新型重组工程负筛选标记的建立和N-乙酰-D-神经氨酸酶催化菌株的优化

摘要

重组是同源重组介导的基因工程，通过生物体内诱导产生的同源重组酶进行，是一种高效的适用于体内遗传工程的方法，不受连接酶和限制性核酸内切酶的限制，可以在任何位点实现DNA分子的重组修饰，在基因敲除、点突变等方面有广泛的应用，具有操作简单、快速高效等优点。
　　负筛选标记是针对作为正选择标记的抗生素抗性基因而言的，含有此基因时不能存活的一种基因类型，广泛运用于基因克隆和DNA修饰。本论文提出了一种新型重组工程介导的诱导型ccdB基因的负筛选方法，据报道，与galK、thyA、sacB、tolC等负筛选标记相比，来源于F质粒、作用于DNA拓朴异构酶Ⅱ而呈现毒性的ccdB基因筛选效率最为高效。
　　在实验中，我们选择抗生素抗性基因和诱导型ccdB基因联合使用，plac启动子置于ccdB之前使得在IPTG诱导下表达ccdB，诱导型ccdB基因作为负筛选标记，只需要加入诱导剂便可得到筛选，还可以实现对不具有耐受CcdB毒性蛋白的菌株的修饰。以大肠杆菌DH10B基因组上lacZ基因的敲除为例说明，通过PCR引入50bp的同源臂，构建HA l-aacCl-plac-ccdB-HA2的基因盒，与目的基因发生同源重组，在庆大霉素抗性筛选之下获得含有诱导型ccdB基因的突变菌株，然后利用ccdB作为筛选标记，成功获得含有mKan、bla*目的菌株和无痕敲除的菌株。在诱导型ccdB基因的筛选下，分别将pir116基因和重组酶基因成功敲入到DH10B的lacZ区域，pir116基因能有容纳R6K复制子的质粒，并且使其呈现高拷贝，不再仅仅局限于BUN20作为宿主菌。重组酶基因存在于突变菌株的基因组上，直接加入L-阿拉伯糖诱导重组酶表达，实现线性DNA片段间的同源重组，或实现线性DNA与环状质粒的同源重组，操作简单高效。将I-SceI基因成功敲入到MG1655的uidA区域，重组效率达到67.5％，I-SceI酶能够介导双链断裂修复，相对于质粒水平，将I-SceI基因敲入到基因组水平上比在质粒水平上更加稳定的存在与表达，对同源重组中抗性筛选标记的敲除具有重大意义。
　　N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)以及其衍生物是非常重要的生物分子，这些糖分子往往处于大分子物质的末端，具有重要的生物学功能和医用价值。在合成Neu5Ac的方法中，全细胞催化法合成Neu5Ac的方法因其具有操作简单，成本低，环保等优点而广受欢迎。实验中在菌株LS2802的基础上，利用Red重组工程对菌株进行优化，将降低胞内GlcNAc的有关基因nagABE、manXYZ、fucIK成功敲除，阻断代谢途径，将有利于生成Neu5Ac有关的基因glmS*72、ScGNA1整合到同一基因组上共表达，获得了一系列生产神经氨酸的菌株。

目录

声明

名词简写

摘要

第一章 综述

1 重组工程

1．1 重组工程概述

1．2 同源重组

1．3 重组工程的作用机理及研究进展

2 基于重组工程的负筛选标记

2．1 负筛选标记的概述

2．2 ccdB基因

3 神经氨酸

3．1 N-乙酰-D-神经氨酸的合成

3．2 与Neu5Ac合成相关的酶

第二章 新型重组工程负筛选标记的建立

第一节 基于重组工程中诱导型ccdB基因菌株的构建

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

第二节 基于重组工程中诱导型ccdB基因负筛选标记的建立

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

第三节 诱导型ccdB基因作为负筛选标记的局限性

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

第三章 利用负筛选标记构建表达重组酶的菌株

第一节 系列含ccdB基因的克隆载体的构建

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

第二节 利用负筛选标记构建表达重组酶的菌株

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

第四章 N-乙酰-D-神经氨酸酶催化菌株的优化

1．1 实验材料

1．1．1 所用菌株以及质粒

1．1．2 引物合成及测序

1．1．3 主要试剂及溶剂

1．1．4 主要仪器设备

1．2 实验方法

1．2．1 常规分子生物学操作方法

1．2．2 乙醇沉淀法回收DNA片段

1．2．3 含T7-glmS*72基因克隆的构建

1．2．4 含T7-ScGNA1基因克隆的构建

1．2．5 nanA基因敲除克隆的构建

1．2．6 重组工程表达重组酶的质粒

1．2．7 基于重组工程的基因敲除和敲入的机理

1．2．8 抗性基因盒的转化

1．2．9 硫酸卡那霉素抗性基因的消除

1．3 实验结果

1．3．1 含T7-glmS*72质粒的构建结果

1．3．2 含T7-ScGNA1基因盒的构建

1．3．3 nanA基因敲除克隆的构建结果

1．3．4 基于神经氨酸酶催化菌株的优化结果

1．3．5 神经氨酸高产菌株的构建结果

1．3．6 nanA基因敲除基因型的验证

1．4 讨论

总结

参考文献

在读期间发表的学术论文及专利

致谢