UAs-GAL4高表达miRNA果蝇株构建及免疫相关miRNA筛选

摘要

microRNA(miRNA)是一类非编码小RNA，广泛存在于真核生物细胞内，在精细调控基因表达及生物生长发育过程方面发挥着重要作用。最近的一些研究表明miRNA在多个方面参与了免疫调控反应，然而，目前关于miRNA介导的先天免疫调控作用机制仍然不十分清晰，需要进一步的深入研究。果蝇是重要的模式生物，在生物学研究中有着极其重要的作用。对果蝇免疫相关miRNA的识别、验证及其调控关系的研究，不仅对揭示果蝇自身免疫系统发育和响应机制有着重要的意义，而且也有助于理解脊椎动物中miRNA的起源、进化和调控方式。目前在果蝇中已经报道的与免疫作用相关的miRNA仅仅有miR-8、miR-let-7和miR-125。因此，为了识别更多的果蝇免疫相关的miRNA，在本论文中，首先构建了UAS-GAL4高表达miRNA果蝇体系，进一步用miR-8和miR-let-7验证已构建的UAS-GAL4高表达miRNA系统的可靠性，在此基础上，利用已构建好的UAS-GAL4高表达miRNA体系对果蝇免疫相关miRNA进行筛选和验证。本论文研究获得了以下主要结果:
　　(1)首先利用基因型为da-Ga14和pp1-Ga14的果蝇分别与不同miRNA的果蝇突变株进行杂交，收集高表达miRNA的子代（da-Ga14/UAS-miRNA），发现该基因的果蝇没有子代，均在胚胎期致死，这个结果表明利用da-Ga14驱动基因在果蝇全身的高表达会导致果蝇致死。然而，我们也能收集到极其少数的高表达miRNA的子代(pp1-Ga14/UAS-miRNA)，并通过荧光定量PCR分析发现，高表达miRNA的子代(pp1-Ga14/UAS-miRNA)果蝇体内的miRNA比对照组有显著的上调，说明pp1-Ga14可以驱动基因在果蝇脂肪体内高表达，但是收集效率比较低。
　　(2)为了构建稳定的表达系统，进一步构建了Ga14-Ga180ts驱动系统，我们将不同UAS-miRNA基因型的果蝇与Ga14-Ga180ts基因型的果蝇进行杂交。首先在18℃的环境中培养，待子代有成虫羽化，立即收集相应的基因型的子代移到29℃的环境中培养，激活Ga14蛋白的表达，进而驱动miRNA的表达，发现果蝇能在特定的时期激活miRNA的表达。本论文利用该Tub-Ga180ts; UAS-miRNA/Tub-Ga14系统实现了果蝇miRNA高表达且效果显著。
　　(3)利用miR-8和miR-let-7，对上述构建的Tub-Ga180ts; UAS-miRNA/Tub-Ga14系统进行验证。在高表达miRNA果蝇株Tub-Ga180ts; UAS-miR-8/Tub-Ga14和Tub-Ga180ts; UAS-miR-let-7/Tub-Ga14体内，miRNA的表达与对照组相比有显著上调，同时对高表达miR-8和miR-let-7的果蝇株的Toll和Imd信号通路进行了研究，发现Tub-Ga180ts; UAS-miR-8/Tub-Ga14高表达株体内的Drosomycin表达量与对照组相比显著下调，也即miR-8通过调节果蝇的Toll信号通路Drosomycin的表达从而调节果蝇的免疫，这与已有的研究结果一致;这个结果同时也证明了我们构建的Tub-Ga180ts; UAS-miRNA/Tub-Ga14系统的可靠性。此外，在果蝇S2细胞中证实了miR-let-7也会影响果蝇Imd通路Diptericin的表达。然而我们也发现，在果蝇体内miR-let-7不会抑制果蝇Diptericin的表达。
　　(4)利用生物信息学技术对果蝇可能与免疫有关的miRNA进行了分析，在此基础上，利用Tub-Ga180ts; UAS-miRNA/Tub-Ga14系统分别高表达了miR-34、miR-375和miR-958，并通过荧光定量PCR检测了高表达果蝇体内的miRNA和Drosomycin及Diptericin的表达量。结果表明miR-34、miR-375和miR-958的表达均显著上调，而仅有Tub-Ga180ts; UAS-miR-958/Tub-Ga14果蝇株体内的Drosomycin的表达量下调，说明miR-958与果蝇的Toll免疫信号通路有关，调控着果蝇的免疫。本论文不仅初步验证了miR-958的免疫功能，而且同时也进一步验证了Tub-Ga180ts; UAS-miRNA/Tub-Ga14系统的可行性。
　　本论文结果为利用Tub-Ga180ts; UAS-miRNA/Tub-Ga14系统在果蝇体内高表达miRNA提供了帮助，并为更深入的研究果蝇miRNA的免疫功能提供了重要的基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 microRNA

1．1．1 miRNA的发现历程

1．1．2 miRNA的主要特征

1．1．3 miRNA的发生与生物活性

1．1．4 miRNA的生物学功能

1．1．5 miRNA的研究进展

1．2 果蝇的免疫

1．2．1 果蝇免疫概况

1．2．2 果蝇的细胞免疫

1．2．3 果蝇的体液免疫

1．2．4 果蝇体液免疫的模式识别受体

1．3．miRNA与果蝇免疫

1．4 GAL4-UAS体系与果蝇免疫

1．4．1 GAL4-UAS体系的简介

1．4．2 GAL4-UAS系统的应用及常用的GAL4

1．5 本论文研究意义及创新

1．6 技术路线

1．6．1 黑腹果蝇GAL4-UAS高表达miRNA果蝇体系的构建及免疫miRNA的筛选

第二章 构建UAS-GAL4果蝇体系的探索

2．1 实验材料、试剂与仪器

2．1．1 果蝇的获得、培养与杂交

2．1．2 实验试剂和仪器

2．2 实验方法

2．2．1 UAS-miRNA／Gal4果蝇体系的构建

2．2．2 果蝇miRNA的提取与实时荧光定量PCR

2．3 结果与分析

2．3．1 基因型为UAS-miRNA的果蝇与不同Gal4果蝇株杂交情况

2．3．2 基因型为UAS-miRNA的果蝇与ppl-Gal4的果蝇杂交子代定量检测

2．3．3 基因型为UAS-miRNA的果蝇与基因型为+／Tub-Gal80ts；+／Tub-Gal4的果蝇杂交子代定量检测

2．4 讨论

第三章 Tub-Gal80ts；UAS-miRNA／Tub-Gal4系统的验证

3．1 实验材料、试剂与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂与仪器

3．2 实验方法

3．2．1 高表达miR-8和miR-let-7果蝇株的构建

3．2．2．果蝇RNA的提取与实时荧光定量PCR

3．3 结果与分析

3．3．1 miRNA的实时荧光定量PCR

3．3．2 Drosomycin和Diptericin的实时荧光定量PCR

3．4 讨论

第四章 生物信息学预测免疫相关的miRNAs

4．1 实验仪器及生物软件

4．2 实验方法

4．2．1 果蝇miRNA的靶基因预测

4．3 结果与分析

4．3．1 预测结果初步分析

4．3．2 miRNA与靶标关系

4．3．3 筛选可能与免疫相关的miRNA

4．4 讨论

第五章 预测的免疫miRNA的初步验证

5．1 实验材料、试剂与仪器

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验试剂与仪器

5．2 实验方法

5．2．1 高表达miRNA果蝇株的构建

5．2．2 果蝇RNA的提取与实时荧光定量PCR

5．3 结果与分析

5．3．1 miRNA的实时荧光定量PCR

5．3．2 Drosomycin和Diptericin的实时荧光定量PCR

5．4 讨论

总结与展望

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文及研究成就

致谢