构建临床相关的寡灶/多灶型转移模型及miRNA-200c的高表达对寡灶转移细胞株体外特性影响研究

摘要

背景：肿瘤转移是造成死亡的重要原因。但在我们早期临床和基础研究展示了转移灶数目有限（转移病灶数<5或全身受累器官数<5）、稳定或进展缓慢的寡灶型转移是一个有异于进展迅速的多灶型转移（转移病灶数>5或全身受累器官数>5）的临床诊断和治疗的新实体。25％的寡灶型病人在接受寡灶型转移针对性治疗后能达治愈，而从寡灶向多灶型转移的演变是治疗失败的根本原因。我们最近的临床观察显示了 miR-200c的差异表达能够分辩呈现稳定寡灶型转移和由寡灶向多灶转移演进的病人，预示miR-200c有可能是调控寡灶向多灶型转移演进的重要机制之一。因此本课题欲从分子、细胞和肿瘤的不同层面，来阐明 miR-200C对促进肿瘤寡灶型向多灶型转移演进的基因调控机制。
　　目的：建立与临床相关的寡灶/多灶转移动物模型并探索miR-200c对寡灶型转移肿瘤细胞株体外特性的影响。
　　方法：首先，我们通过尾静脉注射转移能力强并带有GFP表达的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435建立与临床相关的寡灶/多灶转移裸鼠模型，大约10~12周之后解剖裸鼠，用荧光镜和470nm蓝色激光手电筒能清晰看到体内肿瘤转移情况，拟获取稳定的寡灶型转移和多灶型转移的细胞株。由于 miRNA-200c在寡灶和多灶型转移细胞中的表达差异明显，故通过慢病毒感染建立稳定高调miRNA-200c表达的寡灶型转移细胞株（MDA-435-OL-200c），并同时建立阴性对照组（感染空质粒LV3NC）和阳性对照组（多灶型细胞株），通过CCK-8增殖曲线测定、琼脂平板克隆实验、transwell小室迁移和侵袭实验来阐明高调 miRNA-200c对寡灶型转移细胞体外特性的影响以及高调目的基因后寡灶型与多灶型转移细胞株体外特性的不同和联系。
　　结果：⑴根据寡灶型和多灶型转移的临床定义，我们于肺上获取了疑似寡灶型转移和多灶型转移的细胞株。并得到了除了肺以外的其他组织器官的寡灶和多灶的衍生细胞株，同时证实了我们建立的动物模型的稳定性以及获取的寡灶型转移细胞和多灶型转移细胞的稳定性。⑵慢病毒感染miRNA-200c质粒后，经流式筛选 GFP表达阳性细胞，荧光显微镜拍照验证及荧光定量PCR复检miRNA-200c的高调，确保了病毒感染的有效性，成功建立稳定高表达miRNA-200c的寡灶型细胞株。⑶琼脂平板克隆实验结果显示高调miRNA-200c的寡灶型细胞克隆斑形成率与阳性对照多灶型细胞相当，而高于阴性对照实验组，差异具有统计学意义。⑷CCK-8细胞增殖曲线测定，发现三个组别细胞增殖能力相当，增殖曲线重合率高且倍增时间相近。⑸transwell小室迁移实验结果显示高调 miRNA-200c后寡灶型细胞迁移能力上升，细胞活力与多灶型细胞相似，稍高于阴性对照组，差异有统计学意义。6、transwell小室侵袭实验结果如迁移实验所述，P<0.05。
　　结论：①建立了与临床相关的寡灶转移与多灶转移的动物模型，并获取了稳定的寡灶转移细胞株和多灶转移细胞株。②寡灶型细胞株稳定高调 miRNA-200c后体外特性研究描述中有一定程度上呈现出多灶型细胞株的特性，这与我们之前短期高调寡灶细胞miRNA-200c后的研究结果吻合，说明 miRNA-200c有促进已有转移能力的肿瘤细胞的转移和侵袭能力。③通过前期研究及本课题研究，miRNA-200c高调后对单个寡灶转移细胞存活能力及迁移、侵袭能力均有促进作用，说明miRNA-200c可能成为寡灶型转移肿瘤针对性治疗的新靶点。④对这一过程的调控miRNA-200c可能不是唯一的一个基因，并且miRNA-200c对寡灶型转移到多灶型转移的调控也可能不只是一个靶基因，这需要接下来正在进行中的活体实验的进一步阐述。

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前言

参考文献

第一章：稳定寡灶/多灶转移细胞株及移植瘤动物模型的构建

1实验材料和仪器

2实验方法

3实验结果

4讨论

第二章：稳定高调microRNA-200c细胞株的建立

1实验材料和仪器

2实验方法

3实验结果

4讨论

第三章 稳定高调miRNA-200c细胞株体外特性研究

1材料和主要仪器

2实验方法

3实验结果

4讨论

参考文献

文献综述: MicroRNA-200c与肿瘤发生的关系

致谢

硕士期间发表的论文