microRNA在果蝇Toll信号免疫响应中的调控作用研究

摘要

果蝇(Drosophila melanogaster)作为重要的模式动物，其便捷的遗传可操作性、完备的基因组注释以及丰富的突变株种类，为研究果蝇免疫稳态的调控机制提供了极大的便利，也为研究昆虫天然免疫与人类天然免疫之间的关系架起了桥梁。果蝇先天免疫响应主要包括两个不同的信号通路:Toll和Imd信号通路，这两个信号通路分别与哺乳动物先天免疫应答过程中的TLR信号通路和TNF-α信号通路具有同源性，表明果蝇与哺乳动物在先天免疫调控途径上存在着共同的进化起源。因此，深入开展果蝇免疫调控机制的研究，为进一步揭示其他昆虫抗病原菌感染的作用机制，以及阐明哺乳动物先天性免疫的调控机制等都具有重要的理论和实践意义。
　　microRNA(miRNA)是与转录后基因沉默相关的一类长度为21～25nt的非编码小RNA，在基因表达调控以及维持生物体内稳态过程中都起着极其重要的作用。当免疫应答被过度激活或不足时，将会对生物个体造成不同程度的损伤。因此，生物体必须具备相应的保护机制来维持免疫稳态，以防止免疫应答因过度或不足所造成的伤害。果蝇Toll信号通路作为果蝇免疫应答的重要通路之一，其调控过程必定是一个十分精细的过程，涉及的调控因子可能既有各种信号通路蛋白、转录因子，亦有多种miRNA参与其中。然而，目前有关miRNA在果蝇Toll信号通路中的调控作用范围及调控作用机制仍不十分清晰，需作进一步的深入研究。为此，本论文围绕miRNA在果蝇Toll信号通路中的调控机制这一重要科学问题，开展了较为系统的研究工作:
　　1.利用small RNA-seq技术，考察了革兰氏阳性菌藤黄微球菌（M.luteus）感染野生型果蝇(w1118)3h、12h和24h后的果蝇及未感染的野生型果蝇（w1118，对照）的miRNA表达情况，共计鉴定出445个果蝇miRNA;感染M.luteus3h和12h后的果蝇与对照组果蝇比较，分别出现了6和14个差异表达的miRNA，而感染24h后的果蝇差异表达的miRNA数量则显著增加到86个。
　　2.为了对潜在的免疫应答相关的miRNA进行筛选和鉴定，利用果蝇全身高表达系统Gal80ts-tub-Gal4，构建了41株UAS-miRNA lines果蝇高表达品系，在所有的果蝇高表达品系中共包含了之前分析得到的93个差异表达miRNA中的60个miRNA。通过实验结果得知，其中有8个miRNA极可能参与了革兰氏阳性菌激活的果蝇Toll信号通路的负调控过程。这8个miRNA分别是:miR-310家族的miR-310、miR-311、miR-312、miR-313及miR-317、miR-963、miR-964和miR-958。
　　3.为了考察miR-958和miR-310家族分子负调控果蝇Toll信号通路的作用机制，利用miRanda、PITA和Targetscan三个靶基因预测软件，分别预测了miR-958和miR-310家族分子在果蝇全基因组范围内的靶基因。分析结果显示，miR-958调控果蝇Toll信号通路的潜在靶基因是Toll和Dif,miR-310家族分子调控果蝇Toll信号通路的潜在靶基因是Toll、Cactus和Drosomycin。
　　4.采用荧光素酶报告实验对miR-958和miR-310家族分子的潜在靶基因进行了鉴定。鉴定结果显示，miR-958可以与靶基因Toll和Dif相互作用，而miR-310家族分子只能与靶基因Drosomycin相互作用，却不能和另外两个预测的靶基因Toll和Cactus相互作用。
　　5.通过qRT-PCR和Western Blotting检测发现，成簇的miR-310～313的表达比单个miR-310家族分子的表达对抗菌肽Drosomycin抑制作用更强，表明这种同家族分子共同作用的形式对于miR-310家族调控果蝇Toll信号通路具有重要意义;而miR-958的表达能够同时显著抑制Toll和Dif的蛋白表达水平，表明miRNA在调控果蝇Toll信号通路中展现出了丰富的空间性和层次性。
　　本论文的研究结果表明，miRNA在果蝇Toll信号免疫响应中发挥了重要的调控作用，其中miR-310家族分子是通过直接抑制果蝇Toll信号通路激活产生的抗菌肽分子Drosomycin的表达来调控果蝇的免疫应答，而miR-958则是通过抑制Toll信号通路中的关键基因Toll和Dif的表达，间接负调节了抗菌肽Drosomycin表达。这些研究结果不仅揭示了miR-958和miR-310家族分子的新功能和调控模式，而且亦揭示了它们调控Toll信号通路的主要分子机制。

目录

声明

摘要

主要缩略词

第1章 绪论

1．1 miRNA的发现及产生过程

1．1．1 miRNA的发现

1．1．2 miRNA的产生过程

1．2 miRNA在调控免疫耐受方面的重要意义

1．2．1 miRNA在免疫系统调控中的方式

1．2．2 miRNA对免疫信号网络的调控作用

1．2．3 miRNA对免疫应答和耐受的调控

1．3 miRNA参与果蝇免疫应答调控的研究进展

1．3．1 果蝇是一个很好的研究模型

1．3．2 miRNA靶基因的预测

1．3．3 免疫相关的miRNA在昆虫中的研究进展

1．4 本论文的研究目的及意义

1．5 本论文的创新点

1．6 本论文的技术路线

第2章 感染M．lutes果蝇的small RNA-seq分析

2．1 引言

2．2 材料、试剂和仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 果蝇培养

2．3．2 果蝇感染实验

2．3．3 果蝇总RNA提取

2．3．4 果蝇mRNA实时荧光定量PCR

2．3．5 样品的准备和small RNA-seq

2．3．6 果蝇miRNA实时荧光定量PCR检测

2．4 实验结果

2．4．1 果蝇Toll信号通路基因不同时间点的表达分析

2．4．2 Small RNA-seq的结果分析

2．4．3 差异表达的miRNA分析

2．4．4 Small RNA-seq结果验证

2．5 讨论

第3章 果蝇Toll信号通路相关miRNA的筛选与鉴定

3．1 引言

3．2 材料、试剂和仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．2 果蝇Gal80ts-tub-Gal4系统的构建

3．3．3 果蝇总RNA提取

3．3．4 果蝇mRNA实时荧光定量PCR

3．3．5 果蝇miRNA实时荧光定量PCR检测

3．4 实验结果

3．4．1 Gal80ts-tub-Gal4系统的工作原理

3．4．2 果蝇Toll信号通路相关miRNA的筛选结果

3．4．3 miR-958和miR-310家族分子在果蝇刺激后不同时间点的表达情况

3．4．4 Drosomycin-GFP系统证明miR-958和miR-310家族具有负调控作用

3．5 讨论

第4章 miR-958和miR-310家族分子靶基因的预测

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 数据收集

4．2．2 靶基因预测软件

4．2．3 Draw Venn Diagram和Cytoscape软件分析

4．3 实验结果

4．3．2 Toll信号通路相关的miR-310家族靶基因预测结果

4．4 讨论

第5章 miR-958和miR-310家族分子靶基因的体外验证

5．1 引言

5．2 材料、试剂和仪器

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验试剂

5．2．3 实验仪器

5．3 实验方法

5．3．1 果蝇S2细胞的培养

5．3．2 质粒构建

5．3．3 定点突变质粒的构建

5．3．4 果蝇S2细胞的转染

5．3．5 Dual-Glo lueiferase reporter检测

5．4 实验结果

5．4．1 双荧光素酶报告系统检测原理

5．4．2 miR-958和miR-310家族的靶位点信息

5．4．3 双荧光素酶报告检测结果

5．5 讨论

第6章 miR-958和miR-310家族分子靶基因的体内验证

6．1 引言

6．2 材料、试剂和仪器

6．2．1 实验材料

6．2．2 实验试剂

6．2．3 实验仪器

6．3 实验方法

6．3．1 果蝇总RNA提取

6．3．2 果蝇mRNA实时荧光定量PCR

6．3．3 果蝇总蛋白的提取

6．3．4 Western Blotting

6．4 实验结果

6．4．1 miR-310家族靶基因体内检测结果

6．4．2 miR-958靶基因体内检测结果

6．5 讨论

第7章 结论

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢