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【6h】

miR-964在果蝇Toll免疫响应中的调控作用研究

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目录

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摘要

第1章绪论

1.1 miRNA的研究进展

1.1.1 miRNA的发现历程

1.1.2 miRNA的结构及其分类

1.1.3 miRNA的生物合成及作用机制

1.1.4 miRNA的表达特征

1.1.5 miRNA的功能

1.2果蝇的免疫研究进展

1.2.1果蝇的生物学特性以及优势

1.2.2果蝇的免疫学概况

1.2.3果蝇的体液免疫

1.2.4果蝇的细胞免疫

1.3 miRNA调控果蝇免疫的研究进展

1.4本论文研究的意义

1.5本论文的创新点

1.6本论文的技术路线

2.1引言

2.2实验材料、试剂和仪器

2.2.1实验材料

2.2.2实验试剂

2.2.3实验仪器

2.3实验方法

2.3.1果蝇的饲养

2.3.2果蝇样品的收集

2.3.3果蝇的菌液刺激

2.3.4果蝇致死率的观察

2.4实验结果与分析

2.4.1 miR-964相关果蝇株生存情况

2.5讨论

3.1引言

3.2实验材料、试剂和仪器

3.2.1实验材料

3.2.2实验试剂

3.2.3实验仪器

3.3实验方法

3.3.1果蝇的饲养

3.3.2果蝇样品的收集

3.3.3果蝇的菌液刺激

3.3.4 miR-964回复果蝇的构建

3.3.5果蝇Drosomycin-GFP报告基因系统

3.3.6果蝇的总RNA的提取

3.3.7果蝇的基因实时荧光定量PCR

3.3.8果蝇的miRNA实时荧光定量PCR

3.4实验结果与分析

3.4.2 miR-964相关果蝇株受M.luteus刺激后体内抗菌肽基因Drs的表达量

3.4.3 miR-964回复果蝇检测结果

3.5讨论

第4章miR-964靶基因的预测和筛选

4.1引言

4.2实验材料

4.2.2 miRanda预测软件

4.2.3 PITA预测软件

4.3实验方法

4.3.1数据收集

4.3.2靶基因预测软件

4.4.1 Toll信号通路相关的miR-964靶基因预测结果

4.5讨论

第5章体外验证miR-964靶标关系

5.1引言

5.2实验材料、试剂和仪器

5.2.1实验材料

5.2.2实验试剂

5.2.3实验仪器

5.3实验方法

5.3.2双荧光素酶报告系统实验的构建和检测

5.4实验结果与分析

5.4.1 miR-964相关靶位点信息

5.4.2双荧光素酶报告系统实验检测结果

5.5讨论

第6章体内验证miR-964靶标关系

6.1引言

6.2实验材料、试剂和仪器

6.2.1实验材料

6.2.2实验试剂

6.2.3实验仪器

6.3实验方法

6.3.1果蝇的饲养

6.3.2果蝇样品的收集

6.3.4果蝇的总RNA的提取

6.3.5果蝇的基因实时荧光定量PCR

6.3.6 Western Blotting

6.4实验结果与分析

6.4.1 miR-964高表达果蝇受M.luteus刺激后体内其他基因的表达量

6.4.2 Western Blotting结果

6.5讨论

第7章结论

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢

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摘要

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)作为模式生物在研究先天免疫机制方面起到了重要作用,而Toll通路是果蝇中最重要的先天免疫通路之一,能够通过一系列信号传导抵抗革兰氏阳性菌的入侵。最近的许多研究表明,microRNA(miRNA)在果蝇免疫信号传递过程中发挥着重要的调控作用。miRNA是一类广泛存在于动植物基因组中长约21-24nt的小非编码RNA,通过结合靶基因mRNA的特定位点,抑制mRNA的翻译或诱导mRNA的降解,介导多种重要生理活动与过程,在转录后水平调控基因的表达。在本实验室前期的工作中,通过高通量测序的筛选,发现miR-964在果蝇受革兰氏阳性菌刺激后发生了显著的下调,据此猜测miR-964可能作为果蝇Toll免疫响应中的重要调控因子。因此,本论文采用实验生物学和生物信息学有机结合的方法,通过体内、体外实验证明果蝇miR-964能够直接靶向抗菌肽基因Drosomycin(Drs)来调控Toll信号通路。本论文所取得的主要实验研究结果如下:
  1.利用革兰氏阳性菌粪肠球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis)分别感染miR-964高表达果蝇、野生型果蝇(w1118)和miR-964基因敲除果蝇,通过生存率分析实验发现miR-964高表达果蝇的生存率显著低于野生型果蝇和miR-964基因敲除果蝇的生存率。
  2.通过实时荧光定量(qRT-PCR)实验检测野生型果蝇(w1118)在感染革兰氏阳性菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus,M.luteus)后miR-964基因的表达,并发现感染后24h、48h和72h均有显著上升;而miR-964高表达果蝇在感染M.luteus24h后Drs表达量显著下降,miR-964敲除果蝇在感染M.luteus12h和24h后Drs表达量显著上升。通过构建miR-964表达回复果蝇,并经qRT-PCR和GFP绿色荧光蛋白检测发现抗菌肽基因Drs的表达量得到了回复。实验证明,果蝇miR-964能够响应革兰氏阳性菌的刺激,并影响Toll通路下游抗菌肽Drs的表达。
  3.为了进一步研究果蝇miR-964影响Toll通路的分子机制,利用TargetScan、miRanda和PITA软件对miR-964的靶基因进行了预测并取交集,获取了两个可能受miR-964调控的Toll信号通路中的相关基因—Spz和Drs。
  4.通过双荧光素酶报告基因系统对miR-964靶基因进行体外验证,证明Drs是miR-964的直接靶基因。
  5.在果蝇体内利用qRT-PCR和Western Blotting的方法再次验证了miR-964和Drs基因的靶标关系,进一步证实miR-964是直接靶向抗菌肽基因Drs的。
  本研究揭示miR-964能通过直接靶向基因Drs的3'UTR调控抗菌肽Drs的表达来对Toll信号通路进行负反馈调节,从而影响果蝇先天性免疫的作用机制,为研究miRNA在先天免疫中的功能提供了新的证据和重要的参考。

著录项

  • 作者

    徐娇;

  • 作者单位

    南京师范大学;

  • 授予单位 南京师范大学;
  • 学科 生物学;遗传学
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 马飞;
  • 年度 2018
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 Q342.4;
  • 关键词

    生物学; Toll免疫通路; 微小核糖核酸-964; 抗菌肽基因;

  • 入库时间 2022-08-17 10:53:25

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