miR-981在果蝇Imd免疫响应中的调控作用研究

摘要

黑腹果蝇作为重要的生物学研究模式动物之一，在研究基因表达调控、神经科学、人类疾病及遗传机制等多个研究领域发挥出了重要作用。目前，有关果蝇的先天性免疫方面的研究已经取得了诸多的成就，主要包括体液免疫和细胞免疫，其中Toll和Imd是果蝇最重要的体液免疫方式，并在近些年的研究过程中鉴定出了很多参与免疫响应的基因。MicroRNA(miRNA)是非编码小RNA家族的一员，长度约为21-24nt的单链小分子RNA。miRNA可以通过靶向一个或多个靶基因，并且抑制靶基因的翻译水平来调节基因的表达。而在果蝇体内，miRNA是否会通过与免疫基因相互作用来调节免疫响应，一直是我们感兴趣的问题。目前，只有极少的miRNA被发现参与调控果蝇的免疫应答。本论文主要研究的是miR-981对于果蝇Imd免疫信号通路的调控机制，所采取的实验研究和所得结果如下:
　　1.通过革兰氏阴性菌刺激野生型果蝇，然后利用qRT-PCR技术检测3h、6h、12h、24h、48h和72h果蝇体内的miR-981和Imd信号通路的代表性抗菌肽Diptericin的表达量。结果发现，在抗菌肽Diptericin的表达量先由上升随后逐渐降低的整个应答过程中，miR-981的表达量在6h和12h表现出显著的升高，这些结果暗示果蝇Imd信号的激活引起了miR-981表达量的变化。
　　2.利用Tub-Gal80ts/+;Tub-Gal4系统果蝇与UAS-miR-981果蝇杂交，得到miR-981高表达的果蝇株。通过免疫损伤实验发现，在miR-981高表达果蝇体内，Diptericin的表达量表现出显著的下降。然而Attain、Cecropin和Defensin等其他抗菌肽的表达量却没有明显的差异，这些结果暗示miR-981可能直接参与调控抗菌肽Diptericin的表达来调节果蝇Imd信号响应的免疫应答。
　　3.为了进一步验证miR-981和Diptericin之间的作用关系，我们先通过TargetScan和miRanda两种生物信息学预测软件预测了Diptericin和miR-981之间的靶位点信息。预测结果均表明，miR-981和Diptericin存在着直接的靶作用关系。
　　4.为了证实miR-981和Diptericin的作用关系，我们在体外采用双荧光素酶报告系统在果蝇S2细胞内进行进一步研究，结果表明miR-981确实能够抑制Diptericin的表达，而当我们将二者之间的作用靶位点进行突变后，miR-981对Diptericin的抑制作用就不存在了，这表明miR-981直接抑制了Diptericin的表达。
　　5.随后，我们在体内将miR-981高表达果蝇体内的miR-981表达量降至正常水平。在miR-981的表达量降低后，再次检测的结果显示，Diptericin的表达量与对照组相比没有显著的差别。
　　综上所述，我们采用生物学的实验研究手段以及生物信息学的分析方法，研究证明了黑腹果蝇miR-981可以通过直接靶向Diptericin的3'UTR序列进而调控果蝇的Imd免疫信号通路。本论文的研究为探讨miRNA参与果蝇免疫调控提供了参考。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 miRNA的研究进展

1．1．3 miRNA的结构及其特征

1．1．4 miRNA的作用机制

1．1．5 miRNA的功能

1．2 果蝇的免疫研究进展

1．2．2 果蝇的免疫学概况

1．2．3 果蝇与病原微生物

1．2．4 果蝇的体液免疫

1．2．5 果蝇的细胞免疫

1．2．6 果蝇的黑化反应

1．3 miRNA调控果蝇免疫的研究进展

1．3．1 miRNA调控调控抗菌肽的表达

1．3．2 果蝇兔疫的其他方面

1．3．3 研究果蝇miRNA与免疫关系的意义

1．3．4 miR-981调控果蝇免疫的机制研究研究现状

1．4 本论文研究的意义和创新点

1．5 本论文的技术路线

第2章 miR-981在E．coli刺激后的果蝇体内的表达模式分析

2．1 引言

2．2 实验材料、试剂和仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 试剂

2．2．3 仪器

2．3 实验方法

2．3．1 果蝇的饲养

2．3．2 果蝇样品的收集

2．3．3 果蝇的菌种刺激

2．3．4 果蝇的总RRA的提取

2．4．5 果蝇的miRNA实时荧光定量PCR

2．4．6 果蝇的基因实时荧光定量PCR

2．4 实验结果与分析

2．4．1 野生型果蝇受E．coli剌激后Diptoricin的时间点变化检测

2．4．2 野生型果蝇受E．coli刺激后激发miR-981的时间点变化检测

2．5 讨论

3．1 引言

3．2 实验材料、试剂和仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 试剂

3．2．3 仪器

3．3 实验方法

3．3．1 果蝇的杂交

3．3．2 果蝇的菌种刺激

3．3．3 果蝇的总刚A的提取

3．3．4 果蝇的基因实时荧光定量PCR

3．3．5 果蝇总蛋白的提取

3．3．6 Western Blots

3．4 实验结果与分析

3．4．2 miR-981高表达果蝇体内受E．coli刺激后Imd通路Diptericin的表达量

3．4．3 miR-981高表达果蝇体内受E．coli刺激后Imd通路其他重要抗菌肽的表达量

3．5 讨论

第4章 miR-981靶基因的预测和筛选

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 miRanda预测软件

4．4．1 miR-981与靶基因Diptericin的靶位点预测

4．5 讨论

第5章 体外验证miR-981和Diptoricin的靶标关系

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．2 试剂

5．2．3 仪器

5．3 实验方法

5．3．2 双荧光素酶报告系统实验的构建和检测

5．4 实验结果与分析

5．4．2 验证MiR-981与Diptericin的靶标关系

5．5 讨论

第6章 体内验证miR-981与Diptericin的靶标关系

6．1 引言

6．2 实验材料、试剂和仪器

6．2．1 实验材料

6．2．2 试剂

6．2．3 仪器

6．3 实验方法

6．3．1 果蝇的杂交

6．3．2 果蝇的菌种刺激

6．4．1 miR-981表达量回复果蝇的构建

6．4．2 miR-981表达量回复果蝇体内Diptoriain表达量的检测

6．5 讨论

第7章 结论

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢