纤维蛋白原相关蛋白与Kruppel样因子在罗氏沼虾先天免疫中的初步功能研究

摘要

自然界中一般认为高等脊椎动物是既具有先天性免疫，也具有获得性免疫的，而在无脊椎动物中由于缺乏真正的抗体和特异性的免疫性细胞，因此机体的防御反应只有先天性免疫。本文对罗氏沼虾的先天性免疫做出了相关研究。
　　1.WSSV刺激后罗氏沼虾淋巴器官的转录组分析。
　　罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）是一种具有经济重要性的甲壳类动物，一般认为成虾对白斑综合征病毒(WSSV)感染耐受。本研究采用新一代测序来确定WSSV感染淋巴器官和对照组淋巴器官之间的转录组差异。从对照样品和WSSV感染样品中分别产生总共44，606，694和40，384，856个纯净读段并组装成73，658和72，374个基因。基于同源搜索，KEGG，GO和COG分析，21，323个基因被注释。其中，鉴定出4951个差异表达基因，并将其分类到244个代谢途径。以凝血级联和模式识别受体信号通路为例，讨论宿主对WSSV感染的反应。我们还鉴定了12，308个简单序列重复序列，可以进一步用作功能标记。该结果有助于更好地理解虾淋巴器官对WSSV的免疫应答，在缺少虾基因组背景下，可以提供虾的新基因信息。
　　2.纤维蛋白原样凝集素在罗氏沼虾中作为模式识别受体参与先天免疫抗菌反应。
　　纤维蛋白原样凝集素广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中，本次课题从罗氏沼虾中克隆得到一个纤维蛋白原样凝集素基因，命名为MrFREP。罗氏沼虾MrFREP的cDNA全长为1649bp，其中包含一个长1086bp的开放阅读框（ORF），其编码了一个含有361个氨基酸残基的蛋白，5'端有一个74bp的非编码翻译区UTR，3'端有一个包含多聚腺苷酸polyA尾巴，长492bp的非编码翻译区UTR。MrFREP包含一个由20个氨基酸组成的信号肽和一个由223个氨基酸组成的Fibrinogen-related domain(MrFReD)。系统发育树表明，MrFREP与日本囊对虾中的FREP亲缘关系最为接近，有43％的相似性。通过对该基因组织分布和表达模式分析可以看出，MrFREP在罗氏沼虾血细胞，心脏，肝胰腺，鳃，胃，肠道，肌肉中均有所表达，并且在鳃和肠道中具有较高水平的表达量。在受到副溶血弧菌和白斑综合症病毒(WSSV)刺激后基因表达量会在24h时上升。MrFREP的FReD结构域重组蛋白在Ca2+存在的情况下可凝集革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌，并能够与革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌相结合。此外，该重组蛋白还能够结合脂多糖与肽聚糖，并且明显提高虾体内弧菌清除的效率。
　　3.Kruppel样因子参与罗氏沼虾先天免疫反应调控。
　　Kruppel样因子家族在真核生物中广泛存在。MrKLF的cDNA全长为1799bp，其中包含一个长1335bp的开放阅读框(ORF)，其编码了一个含有444个氨基酸残基的蛋白，5'端有一个193bp的非编码翻译区UTR，3'端有一个包含多聚腺苷酸polyA尾巴，长274bp的非编码翻译区UTR。MrKLF包含两个由12和13个氨基酸组成的低复杂度区域(low complexity region)和三个分别由25个、25个和23个氨基酸组成的锌指蛋白结构域。系统发育树表明罗氏沼虾Kruppel样因子与斑节对虾和凡纳滨对虾的Kruppel样因子亲缘关系最为接近，相似性分别达到59％和58％。在mRNA水平上，MrKLF在罗氏沼虾体内广泛分布，其中在肝胰腺、鳃和肠道中的表达量明显高于在其他器官的表达量。在受到白斑综合症病毒和副溶血弧菌刺激时，MrKLF表达量会在24h时降低，并在48h升高。将该基因敲低后，虾体内某些抗菌肽的表达量也会出现降低，受到了MrKLF的调控，表明该基因有可能参与罗氏沼虾先天免疫防御。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．2．1物理屏障

1．2．2细胞免疫

1．2．3体液免疫

1．3转录组分析技术

1．4免疫识别

1．4．1病原相关分子模式(PAMPs)

1．4．2模式识别受体(PRRs)

1．5补体系统

1．6本实验研究意义、内容及技术路线图

第二章白斑综合症病毒刺激后罗氏沼虾淋巴器官的转录组分析

2．1引言

2．2材料和方法

2．2．3新的基因组装配和数据分析

2．2．4差异表达的分析和功能注释

2．2．5简单重复序列的识别与引物设计

2．2．6使用qRT-PCR验证基因

2．3实验结果

2．3．1转录组测序和新的基因组装配

2．3．2罗氏沼虾转录组序列的功能注释和分类

2．3．3差异表达基因(DEGs)的鉴定和功能鉴定

2．3．4差异表达基因(DEGs)的GO网络分析

2．3．5简单序列重复的鉴定

2．3．6通过qRT-PCR验证RNA序列的结果

2．3讨论

第三章纤维蛋白原相关蛋白在罗氏沼虾先天免疫中的功能研究

3．1引言

3．2材料和方法

3．2．1实验动物、菌株和病毒

3．2．2载体、试剂和仪器

3．2．3主要实验试剂配方

3．2．4罗氏沼虾的免疫刺激

3．2．5总RNA的提取

3．2．6 cDNA的合成

3．2．7罗氏沼虾MrFREP cDNA全长克隆

3．2．8 MrFREP的FReD结构域t组蛋白的表达和纯化

3．2．9实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MrFREP的组织分布

3．2．10 MrFREP在mRNA水平上受病原刺激的表达模式

3．2．11细菌结合实验

3．2．12糖结合实验

3．2．13细菌凝集实验

3．2．14细蕾清除实验

3．3实验结果

3．3．1 MrFREP全长cDNA克隆和序列分析

3．3．2 MrFREP组织分布

3．3．3 MrFREP在白斑综合症病毒感染和弧菌刺激后虾体中的表达模式

3．3．4 MrFREP的FReD结构域的重组表达和纯化

3．3．5 MrFReD重组蛋白的细菌结合实验

3．3．6 MrFReD重组蛋白的糖结合实验

3．3．7 MrFReD重组蛋白的细菌凝集实验

3．3．8 MrFReD重组蛋白的细菌清除实验

3．4讨论

第四章罗氏沼虾中Kruppel样因子的克隆和功能研究

4．1引言

4．2材料和方法

4．2．1实验动物、菌株和病毒

4．2．2 载体、试剂和仪器

4．2．5总RNA的提取及cDNA的合成

4．2．6罗氏沼虾MrKLF cDNA全长克隆

4．2．7 MrKLF重组蛋白的表达和纯化

4．2．8实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MrKLF的组织分布

4．2．9 MrKLF在mRNA水平上的表达模式

4．2．10 RNA干扰实验(RNAi)

4．3实验结果

4．3．1 MrKLF的全长cDNA克隆序列分析

4．3．2 MrKLF的组织分布

4．3．3 MrKLF在白斑综合症病毒感染和弧菌刺激后虾体中的表达模式

4．3．4 MrKLF重组表达和纯化

4．3．5 MnKLF的RNA干扰实验和基因沉默后对抗菌肽表达的影响

4．4讨论

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢