与干细胞活性相关的凝血栓蛋白1、凝血栓蛋白2、白细胞介素17B受体和肝素结合表皮生长因子样生长因子和其应用

摘要

本发明的示范性实施例提供与干细胞活性相关的凝血栓蛋白1(TSP-1)、凝血栓蛋白2(TSP-2)、白细胞介素17B受体(IL-17BR)和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)和其应用。

说明书

技术领域

本发明的一个或一个以上实施例涉及与干细胞活性，例如间质干细胞 (mesenchymal stem cell；MSC)活性相关的凝血栓蛋白1(thrombospondin 1； TSP-1)、凝血栓蛋白2(TSP-2)、白细胞介素17B受体(interleukin 17B receptor； IL-17BR)和肝素结合表皮生长因子样生长因子(heparin-binding epidermal  growth factor-like growth factor；HB-EGF)，和其用途。

背景技术

软骨是一种致密厚实的结缔组织，并由分布于硬而灵活的胶状基质中的 软骨细胞构成。软骨不含血管，且营养物通过由基质扩散来供应。软骨分成 三种类型：透明软骨(例如鼻、气管和细支气管的软骨以及关节软骨)、弹 性软骨(例如外耳软骨、耳咽管的一部分和喉软骨的一部分)和纤维软骨(例 如半月板和端板软骨)。软骨的主要目的是提供一个上面可开始骨沉积的框 架并提供一个允许骨头之间关节自由移动的光滑表面。另外，软骨还提供强 而灵活的支撑物。

治疗软骨损伤或软骨损坏有各种疗法。骨关节炎是变性关节炎 (degenerative arthritis)，一般来说，其最初相对较轻，但随着时间和磨损会加 重。就医学治疗来说，已知例如消炎剂(例如双氯芬酸(diclofenac)、布洛 芬(ibuprofen)或萘普生(naproxen))、环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制 剂、氢化可的松(hydrocortisone)、葡糖胺和硫酸软骨素(chondroitin sulfate) 等药物可缓解软骨损失引起的疼痛。

凝血栓蛋白2(thrombospondin-2；TSP-2)是一种展现强抗血管生成活性 的分泌性细胞外基质糖蛋白(伯恩斯坦(Bornstein)等人，2000，基质生物学 (Matrix Biology)19：557-568)。

凝血栓蛋白1(TSP-1)是一种由相同单体构成的多聚糖蛋白。在十二烷 基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel  electrophoresis；SDS-PAGE)中，在还原条件下，所述单体的分子量为约185 千道尔顿。主要多聚体是在非还原凝胶上分子量为约450千道尔顿的三聚 体，且通过沉降平衡得到的分子量类似，单体是135千道尔顿且三聚体是420 千道尔顿。从单体中的氨基酸残基序列预测的分子量是127,524道尔顿，其 不包含糖基化和β-羟基化的贡献。已知TSP-1与细胞粘附、增殖和趋化性有 关。还报导TSP-1可能与恶性肿瘤的发展有关。

白细胞介素17B受体(IL-17BR)是一种人体内由IL17BR基因编码的蛋 白质。IL-17BR是一种特异性结合于IL17B和IL17E，但不结合于IL17和IL17C 的细胞因子受体。

肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)通过结合于erb类的表皮 生长因子样生长因子(EGF)受体(EGFR)来发挥其生物活性。HB-EGF以 高亲和性结合肝素。HB-EGF结合于EGFR来调节生长因子对靶细胞的生物 作用，包含细胞迁移和增殖。HB-EGF对于纤维母细胞、平滑肌细胞和上皮 细胞具有促有丝分裂作用。HB-EGF是一种热敏性阳离子蛋白，分子量为约 22,000道尔顿。已知HB-EGF用于治疗与例如肠细胞坏死和小肠结肠炎等肠 缺血相关的症状。另外，已知HB-EGF可抑制哺乳动物的肝病和肝细胞死亡 并促进肝再生。

尽管已有这些揭示内容，但仍未证明干细胞的软骨分化与TSP-1、TSP-2、 IL-17BR和HB-EGF相关。

发明内容

技术问题

本发明的一个方面提供与干细胞活性相关的凝血栓蛋白1(TSP-1)、 TSP-2、白细胞介素17B受体(IL-17BR)和肝素结合表皮生长因子样生长因 子(HB-EGF)或表达所述物质的干细胞。

本发明的另一个方面提供一种使用与干细胞活性相关的TSP-1、TSP-2、 IL-17BR和HB-EGF或表达所述物质的干细胞的方法。

技术解决方案

根据本发明的实施例，提供一种刺激细胞分化为软骨细胞的组合物，所 述组合物包含选自由凝血栓蛋白2(TSP-2)和表达TSP-2的细胞组成的群组 的至少一个。

TSP-2是一种展现强抗血管生成活性的分泌性细胞外基质糖蛋白(伯恩 斯坦(Bornstein)等人，2000，基质生物学(Matrix Biology)19：557-568)。 TSP-2是一种以二硫键连接的均三聚体糖蛋白，且在人体内，其是由凝血酶 敏感蛋白2(THBS2)基因编码。TSP-2可具有RefSeq NP_003238(人类) (SEQ ID NO：1)或NP_035711(小鼠)(SEQ ID NO：2)中揭示的氨基酸序 列或来源于其的序列。

组合物可进一步包含医药学上可接受的载剂。举例来说，载剂可选自由 培养基、缓冲液和生物相容性聚合物组成的群组。生物相容性聚合物可选自 可在二维或三维结构下支撑细胞和/或维持细胞活性的常用聚合物。举例来 说，生物相容性聚合物可包含至少一种选自由透明质酸、羟基磷灰石、壳聚 糖、胶原蛋白和纤维蛋白组成的群组的聚合物。

组合物可用于治疗或预防软骨的损伤、退化、损失或缺损。软骨的损伤、 退化、损失或缺损可包含关节炎或关节变形。关节炎可为风湿性关节炎或变 性关节炎。举例来说，软骨的损伤、退化、损失或缺损可由选自由以下组成 的群组的至少一个引起：由衰老引起的变性关节炎；由关节超负荷(包含肥 胖)引起的早期变性关节炎；由运动、跌倒、事故等引起的外部损伤；由未 适当治疗由外部损伤引起的软骨损伤继发性发展的变性关节炎；和由韧带损 伤、关节周围的肌肉无力、关节脱位、关节鼠形成和骨生长停滞引起的关节 变形。另外，欲分化为软骨细胞的细胞可为来源于至少一种受软骨损伤、软 骨退化、软骨损失或软骨缺损影响的组织的细胞，例如如滑液、骨膜、骨和 骨髓等组织。

组合物可包含量的范围为约30皮克到约300毫克的TSP-2。举例来说， 组合物可包含量的范围为约10纳克到约300毫克、约100纳克到约300毫克、 约1微克到约300毫克、约10微克到约300毫克或约10微克到约300毫克 的TSP-2。

另外，组合物可包含产生TSP-2的细胞，所述产生TSP-2的细胞的浓度 范围为每毫升约1×10⁴个细胞到每毫升约1×10⁶个细胞、每毫升约5×10⁴个细 胞到每毫升约1×10⁶个细胞、每毫升约2.5×10⁵个细胞到每毫升约1×10⁶个细 胞或每毫升约5×10⁵个细胞到每毫升约1×10⁶个细胞。

组合物可促进活体外或活体内软骨分化。在促进活体内软骨分化的情况 下，发生软骨分化的个体可为哺乳动物。

所述细胞可为干细胞。干细胞可选自由诱导多能干细胞(iPS细胞)、胚 胎干细胞和成人干细胞组成的群组。成人干细胞可选自由间质干细胞(MSC)、 脂肪来源干细胞、内皮干细胞和造血干细胞组成的群组。MSC可来源于哺乳 动物，例如人类。MSC可包含选自由以下组成的群组的至少一个：骨髓来源 间质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell；BM-MSC)、脐带 血来源间质干细胞(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell； UCB-MSC)、脂肪来源间质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell； AD-MSC)、胚胎卵黄囊来源MSC、胎盘来源MSC、皮肤来源MSC、周边 血液来源MSC、肌肉来源MSC、肝脏来源MSC、神经组织来源MSC、骨膜 来源MSC、脐带来源MSC、胎膜来源MSC、滑膜来源MSC、羊膜来源MSC、 半月板来源MSC、前十字韧带来源MSC、关节软骨细胞来源MSC和从包含 MSC的其它组织分离和/或培养的MSC。

细胞可为产生并细胞外分泌TSP-2的细胞。即，细胞自身分泌TSP-2， 并与TSP-2相互作用，分化为软骨细胞。另外，细胞可为接触由其它细胞产 生以分泌或外部投予的TSP-2的细胞。举例来说，接触TSP-2的细胞可为存 在于具有软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损的组织中的细胞。存在 于具有软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损的组织中的细胞可为存在 于受软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损影响的组织中的细胞。受影 响的组织可视软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损的程度而变化。所 述组织可选自由滑液、骨膜、骨和骨髓组成的群组。组织可为具有关节炎或 关节变形的组织。关节炎可为风湿性关节炎或变性关节炎。接触TSP-2的细 胞可为来源于至少一种具有以下情况的组织的细胞：由衰老引起的变性关节 炎；由关节超负荷(包含肥胖)引起的早期变性关节炎；由运动、跌倒、事 故等引起的外部损伤；由未适当治疗由外部损伤引起的软骨损伤继发性发展 的变性关节炎；和由韧带损伤、关节周围的肌肉无力、关节脱位、关节鼠形 成和骨生长停滞引起的关节变形。

“产生TSP-2的细胞”可为天然产生TSP-2的细胞，或经诱导产生TSP-2 的细胞。组合物可进一步包含诱导细胞产生TSP-2的诱导剂。

产生TSP-2的细胞可为干细胞。干细胞可选自由iPS细胞、胚胎干细胞 和成人干细胞组成的群组。成人干细胞可选自由MSC、脂肪来源干细胞、内 皮干细胞和造血干细胞组成的群组。MSC可来源于哺乳动物，例如人类。 MSC可包含选自由以下组成的群组的至少一个：BM-MSC、UCB-MSC、 AD-MSC、胚胎卵黄囊来源MSC、胎盘来源MSC、皮肤来源MSC、周边血 液来源MSC、肌肉来源MSC、肝脏来源MSC、神经组织来源MSC、骨膜来 源MSC、脐带来源MSC、胎膜来源MSC、滑膜来源MSC、羊膜来源MSC、 半月板来源MSC、前十字韧带来源MSC、关节软骨细胞来源MSC和从包含 MSC的其它组织分离和/或培养的MSC。

产生TSP-2的细胞和欲分化为软骨细胞的细胞可彼此相同或不同。即， 产生TSP-2的细胞可通过旁分泌或自分泌机制起作用。欲分化为软骨细胞的 细胞可为产生TSP-2并细胞外分泌TSP-2的细胞。即，细胞自身分泌TSP-2， 且与分泌的TSP-2相互作用，从而分化为软骨细胞。另外，细胞可为接触由 其它细胞产生以分泌或外部投予的TSP-2的细胞。举例来说，接触TSP-2的 细胞可为存在于具有软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损的组织中的 细胞。存在于具有软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损的组织中的细 胞可为存在于组织自身和受软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损影响 的组织中的细胞。受影响的组织可视软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨 缺损的程度而变化。举例来说，所述组织可选自由滑液、骨膜、骨和骨髓组 成的群组。组织可为具有关节炎或关节变形的组织。关节炎可为风湿性关节 炎或变性关节炎。接触TSP-2的细胞可为来源于至少一种具有以下情况的组 织的细胞：由衰老引起的变性关节炎；由关节超负荷(包含肥胖)引起的早 期变性关节炎；由运动、跌倒、事故等引起的外部损伤；由未适当治疗由外 部损伤引起的软骨损伤继发性发展的变性关节炎；和由韧带损伤、关节周围 的肌肉无力、关节脱位、关节鼠形成和骨生长停滞引起的关节变形。

产生TSP-2的细胞可为表达TSP-2的量高于设定值的细胞。所述设定值 可为参考细胞所表达的量。参考细胞可已知具有软骨分化能力。此类分化能 力可通过以下事实来获知：在活体外分化培养基中培养参考细胞以诱导软骨 分化。另外，投予个体的参考细胞可经鉴别具有活体内分化能力。参考细胞 可选自由BM-MSC、纤维母细胞和UCB-MSC组成的群组。UCB-MSC可选 自由C5UCB-MSC、C6UCB-MSC和C7UCB-MSC组成的群组。

设定值可至少为在维持培养基或诱导培养基中分化为软骨细胞且具有低 活性的MSC所表达的量。分化为软骨细胞且具有低活性的MSC可为C5、 C6或C7UCB-MSC。

当产生TSP-2的细胞在维持培养基中培养1天时，设定值可为每毫升每 10⁵个细胞72皮克(72皮克/10⁵个细胞/毫升)或更大。另一方面，当产生TSP-2 的细胞在诱导培养基中团块培养7天时，设定值可为每毫升每10⁵个细胞550 皮克或更大。

设定值可为在选自由以下组成的群组的培养基中表达的TSP-2的值：α- 最低必需培养基(α-minimum essential medium；MEM-α)培养基、MSC维持 培养基(例如含有10％胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)和50微克/毫升 庆大霉素(gentamicin)的MEM-α培养基)和MSC软骨分化培养基(例如 含有高葡萄糖杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium； DMEM)(含有4500毫克/升葡萄糖)、50微克/毫升抗坏血酸盐、0.1微摩 尔浓度地塞米松(dexamethasone)、40微克/毫升L-脯氨酸、100微克/毫升 丙酮酸盐、10纳克/毫升TGF-β3、500纳克/毫升骨形态生成蛋白6(bone  morphogenetic protein 6；BMP-6)、50毫克/毫升ITS+和50微克/毫升庆大霉 素的培养基)。

TSP-2可在细胞溶解物和/或培养物上清液中表达。TSP-2的浓度可在 mRNA水平或蛋白质水平上测量。

组合物可刺激欲分化为软骨细胞的细胞的活性。所述细胞可与表达TSP-2 的细胞相同或不同。

细胞可为产生并细胞外分泌TSP-2的细胞。即，细胞自身分泌TSP-2， 并与TSP-2相互作用，以分化为软骨细胞。另外，细胞可为接触由其它细胞 产生以分泌或外部投予的TSP-2的细胞。举例来说，接触TSP-2的细胞可为 存在于具有软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损的组织中的细胞。存 在于具有软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损的组织中的细胞可为存 在于组织自身或受软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损影响的组织中 的细胞。受影响的组织可视软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损的程 度而变化。所述组织可选自由滑液、骨膜、骨和骨髓组成的群组。组织可为 具有关节炎或关节变形的组织。关节炎可为风湿性关节炎或变性关节炎。接 触TSP-2的细胞可为来源于至少一种具有以下情况的组织的细胞：由衰老引 起的变性关节炎；由关节超负荷(包含肥胖)引起的早期变性关节炎；由运 动、跌倒、事故等引起的外部损伤；由未适当治疗由外部损伤引起的软骨损 伤继发性发展的变性关节炎；和由韧带损伤、关节周围的肌肉无力、关节脱 位、关节鼠形成和骨生长停滞引起的关节变形。举例来说，细胞可位于表达 TSP-2的细胞的附近。

根据本发明的另一实施例，提供一种使个体的细胞分化为软骨细胞的方 法，所述方法包含以足够有效使细胞分化为软骨细胞的量投予包含选自由 TSP-2和表达TSP-2的细胞组成的群组的至少一个的组合物。

足够有效使细胞分化为软骨细胞的量可为足够允许恒定比例的细胞进行 软骨分化的量。所述量可容易由所属领域的技术人员根据所选细胞和表达 TSP-2的细胞来选择。举例来说，量可为允许在1到7天内使总干细胞的至 少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％分化为软骨细胞的量。 已提供有关表达TSP-2的细胞和欲分化为软骨细胞的细胞的详细描述。所述 个体可选自由例如人类、小鼠和兔等哺乳动物组成的群组。

根据本发明的另一实施例，提供一种鉴别干细胞使细胞分化为软骨细胞 的能力的方法，所述方法包含：在培养基中培养干细胞；从培养物中测量选 自由TSP-1、TSP-2、白细胞介素17B受体(IL-17BR)和肝素结合表皮生长 因子样生长因子(HB-EGF)组成的群组的至少一个的浓度；和基于所测量的 浓度鉴别所培养的干细胞的软骨分化和/或诱导能力。

现将详细描述所述方法。方法包含在培养基中培养干细胞。在培养基中 培养干细胞为所属领域所知，因此培养基和条件可由所属领域的技术人员视 所选干细胞而适当选择。

干细胞可选自由iPS细胞、胚胎干细胞和成人干细胞组成的群组。成人 干细胞可选自由MSC、脂肪来源干细胞、内皮干细胞和造血干细胞组成的群 组。MSC可来源于哺乳动物，例如人类。MSC可包含选自由以下组成的群 组的至少一个：BM-MSC、UCB-MSC、脂肪来源MSC、胚胎卵黄囊来源MSC、 胎盘来源MSC、皮肤来源MSC、周边血液来源MSC、肌肉来源MSC、肝脏 来源MSC、神经组织来源MSC、骨膜来源MSC、脐带来源MSC、胎膜来源 MSC、滑膜来源MSC、羊膜来源MSC、半月板来源MSC、前十字韧带来源 MSC、关节软骨细胞来源MSC和从包含MSC的其它组织分离和/或培养的 MSC。

举例来说，干细胞可为MSC，且培养基可为MSC维持培养基或MSC软 骨分化培养基。培养基可选自由以下组成的群组：MEM-α培养基、MSC维 持培养基(例如含有10％FBS和50微克/毫升庆大霉素的MEM-α培养基) 和MSC软骨分化培养基(例如含有高葡萄糖DMEM、50微克/毫升抗坏血酸 盐、0.1微摩尔浓度地塞米松、40微克/毫升L-脯氨酸、100微克/毫升丙酮酸 盐、10纳克/毫升TGF-β3、500纳克/毫升BMP-6、50毫克/毫升ITS+和50微 克/毫升庆大霉素的培养基)。培养过程可使用MSC培养中常用的方法进行。

在培养基中培养干细胞时，仅干细胞可在不包含其它细胞的情况下培养， 或干细胞可与其它细胞一起培养。其它细胞可为产生TSP-2并细胞外分泌 TSP-2的细胞。即，细胞自身分泌TSP-2，并与TSP-2相互作用，从而分化为 软骨细胞。另外，细胞可为接触由其它细胞产生以分泌或外部投予的TSP-2 的细胞。举例来说，接触TSP-2的细胞可为存在于具有软骨损伤、软骨退化、 软骨损失或软骨缺损的组织中的细胞。存在于具有软骨损伤、软骨退化、软 骨损失或软骨缺损的组织中的细胞可为组织自身或存在于受软骨损伤、软骨 退化、软骨损失或软骨缺损影响的组织中的细胞。受影响的组织可视软骨损 伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损的程度而变化。所述组织可选自由滑液、 骨膜、骨和骨髓组成的群组。组织可为具有关节炎或关节变形的组织。关节 炎可为风湿性关节炎或变性关节炎。接触TSP-2的细胞可为来源于至少一种 具有以下情况的组织的细胞：由衰老引起的变性关节炎；由关节超负荷(包 含肥胖)引起的早期变性关节炎；由运动、跌倒、事故等引起的外部损伤； 由未适当治疗由外部损伤引起的软骨损伤继发性发展的变性关节炎；和由韧 带损伤、关节周围的肌肉无力、关节脱位、关节鼠形成和骨生长停滞引起的 关节变形。举例来说，细胞可位于表达TSP-2的细胞的附近。

所述方法包含从培养物中测量选自由TSP-1、TSP-2、IL-17BR和HB-EGF 组成的群组的至少一个的浓度。选自由TSP-1、TSP-2、IL-17BR和HB-EGF 组成的群组的至少一个的浓度可从细胞溶解物或培养物上清液中测量。选自 由TSP-1、TSP-2、IL-17BR和HB-EGF组成的群组的至少一个的浓度可在 mRNA水平或蛋白质水平上测量。mRNA或蛋白质水平上的测量为所属领域 所熟知。举例来说，可使用定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction；PCR) 或酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)。

TSP-1是一种由相同单体构成的多聚糖蛋白。在十二烷基硫酸钠聚丙烯 酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中，在还原条件下，所述单体的分子量为约185 千道尔顿。主要多聚体是在非还原凝胶上分子量为约450千道尔顿的三聚体， 且通过沉降平衡得到的分子量类似，单体是135千道尔顿且三聚体是420千 道尔顿。从单体中的氨基酸残基序列预测的分子量是127,524道尔顿，其不 包含糖基化和β-羟基化的贡献。已知TSP-1与细胞粘附、增殖和趋化性有关。 还报导TSP-1可能与恶性肿瘤的发展有关。TSP-1可具有RefSeq NP_003237 (人类)(SEQ ID NO：3)或NP_035710(小鼠)(SEQ ID NO：4)中揭示的 氨基酸序列或来源于其的序列。

IL-17BR是一种人体内由IL17RB基因编码的蛋白质。IL-17BR是一种特 异性结合于IL17B和IL17E，但不结合于IL17和IL17C的细胞因子受体。 IL-17BR可具有RefSeq NP_758434(人类)(SEQ ID NO：5)或NP_062529 (小鼠)(SEQ ID NO：6)中揭示的氨基酸序列或来源于其的序列。

肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)通过结合于erb类的EGF 受体(EGFR)来发挥其生物活性。HB-EGF以高亲和性结合肝素。HB-EGF 结合于EGFR以调节生长因子对靶细胞的生物作用，包含细胞迁移和增殖。 HB-EGF可具有RefSeq NP_001936(人类)(SEQ ID NO：7)或NP_034545 (小鼠)(SEQ ID NO：8)中揭示的氨基酸序列或来源于其的序列。

所述方法可包含基于所测量的浓度鉴别所培养的干细胞的软骨分化能 力。

鉴别过程可包含比较选自由TSP-1、TSP-2、IL-17BR和HB-EGF组成的 群组的至少一个的浓度与从作为对照组且经鉴别具有软骨分化能力的参考细 胞获得的浓度。

在鉴别过程中，当所测量的浓度高于从参考细胞获得的浓度时，可证实 干细胞具有高的分化为软骨细胞的能力。另一方面，当所测量的浓度低于从 参考细胞获得的浓度或与其相同时，可确定干细胞具有低的分化为软骨细胞 的能力。

鉴别过程可包含在干细胞在维持培养基中单层培养1天的情况下，TSP-2 的表达量大于每1.0×10⁵个细胞72皮克/毫升时，或在干细胞在维持培养基中 团块培养7天的情况下，TSP-2的表达量大于每1.0×10⁵个细胞550皮克/毫升 时，确定干细胞具有高的分化为软骨细胞的能力。干细胞的维持培养基可为 含有MEM-α、10％FBS和50微克/毫升庆大霉素的培养基，且干细胞的软骨 形成诱导培养基可为含有高葡萄糖DMEM、50微克/毫升抗坏血酸盐、0.1微 摩尔浓度地塞米松、40微克/毫升L-脯氨酸、100微克/毫升丙酮酸盐、10纳 克/毫升TGF-β3、500纳克/毫升BMP-6、50毫克/毫升ITS+和50微克/毫升庆 大霉素的培养基。

所述方法可进一步包含比较选自由TSP-1、TSP-2、IL-17BR和HB-EGF 组成的群组的至少一个的所测量的浓度与从作为对照组且经鉴别具有低的分 化为软骨细胞的能力的参考细胞获得的选自由TSP-1、TSP-2、IL-17BR和 HB-EGF组成的群组的至少一个的浓度。

另外，在比较方法中，当选自由TSP-1、TSP-2、IL-17BR和HB-EGF组 成的群组的至少一个的所测量的浓度比从参考细胞获得的选自由TSP-1、 TSP-2、IL-17BR和HB-EGF组成的群组的至少一个的浓度高至少10％、至少 20％或至少30％时，可确定干细胞具有高的分化为软骨细胞的能力。参考细 胞可选自由BM-MSC、纤维母细胞和UCB-MSC组成的群组。UCB-MSC可 选自由C5UCB-MSC、C6UCB-MSC和C7UCB-MSC组成的群组。

根据本发明的另一实施例，提供一种使细胞分化为软骨细胞的方法，所 述方法包含使根据上述方法确定具有高的分化为软骨细胞的能力的细胞分化 为软骨细胞。

分化过程可在活体外或活体内进行。所述方法可包含在细胞软骨分化培 养基中培养确定具有高的分化为软骨细胞的能力的细胞(例如MSC)以使所 述细胞(例如MSC)活体外分化为软骨细胞。在培养过程中，细胞可与生物 相容性聚合物一起培养。

所述生物相容性聚合物可选自可在二维或三维结构下支撑细胞和/或维 持细胞活性的常用聚合物。举例来说，生物相容性聚合物可包含至少一种选 自由透明质酸、羟基磷灰石、壳聚糖、纤维蛋白和胶原蛋白组成的群组的聚 合物。

所述方法可进一步包含向需要软骨分化的个体投予细胞(例如MSC)。 所述个体可为具有软骨损伤、软骨退化、软骨损失或软骨缺损的个体。举例 来说，个体可为具有关节炎或关节变形的个体。关节炎可为风湿性关节炎或 变性关节炎。个体可具有至少一种具有以下情况的组织：由衰老引起的变性 关节炎；由关节超负荷(包含肥胖)引起的早期变性关节炎；由运动、跌倒、 事故等引起的外部损伤；由未适当治疗由外部损伤引起的软骨损伤继发性发 展的变性关节炎；和由韧带损伤、关节周围的肌肉无力、关节脱位、关节鼠 形成和骨生长停滞引起的关节变形。外部损伤包含骨折。投予过程可通过静 脉内注射或肌肉注射来进行，或可在病变部位上局部进行。细胞(例如MSC) 可与载剂一起投予。载剂可为培养基、缓冲液或生物相容性聚合物。所述生 物相容性聚合物可选自可在二维或三维结构下支撑细胞和/或维持细胞活性 的常用聚合物。生物相容性聚合物可包含至少一种选自由透明质酸、羟基磷 灰石、壳聚糖、纤维蛋白和胶原蛋白组成的群组的聚合物。所述细胞可为干 细胞。干细胞可包含选自由iPS细胞、胚胎干细胞和成人干细胞组成的群组 的至少一个。成人干细胞可选自由MSC、脂肪来源干细胞、内皮干细胞和造 血干细胞组成的群组。MSC可来源于哺乳动物，例如人类。MSC可包含选 自由以下组成的群组的至少一个：BM-MSC、UCB-MSC、脂肪来源MSC、 胚胎卵黄囊来源MSC、胎盘来源MSC、皮肤来源MSC、周边血液来源MSC、 肌肉来源MSC、肝脏来源MSC、神经组织来源MSC、骨膜来源MSC、脐带 来源MSC、胎膜来源MSC、滑膜来源MSC、羊膜来源MSC、半月板来源 MSC、前十字韧带来源MSC、关节软骨细胞来源MSC和从包含MSC的其它 组织分离和/或培养的MSC。

根据本发明的另一实施例，提供一种鉴别包含能够分化为软骨细胞的细 胞的样品的方法，所述方法包含在培养基中培养含有细胞的样品；和从培养 物中测量选自由TSP-1、TSP-2、IL-17BR和HB-EGF组成的群组的至少一个 的浓度。

在培养过程中，细胞可为干细胞。干细胞可为UCB-MSC。能够分化为 软骨细胞的细胞可为干细胞，例如UCB-MSC。另外，能够分化为软骨细胞 的细胞可为干细胞，例如UCB-MSC和与干细胞一起培养的其它细胞。其它 细胞可为其它类型的干细胞。其它细胞可为产生TSP-2并细胞外分泌TSP-2 的细胞。即，细胞自身分泌TSP-2，并与TSP-2相互作用，以分化为软骨细 胞。另外，细胞可为接触由其它细胞产生以分泌或外部投予的TSP-2的细胞。 举例来说，接触TSP-2的细胞可为存在于具有软骨损伤、软骨退化、软骨损 失或软骨缺损的组织中的细胞。存在于具有软骨损伤、软骨退化、软骨损失 或软骨缺损的组织中的细胞可为存在于组织自身和受软骨损伤、软骨退化、 软骨损失或软骨缺损影响的组织中的细胞。受影响的组织可视软骨损伤、软 骨退化、软骨损失或软骨缺损的程度而变化。举例来说，所述组织可选自由 滑液、骨膜、骨和骨髓组成的群组。组织可为具有关节炎或关节变形的组织。 关节炎可为风湿性关节炎或变性关节炎。接触TSP-2的细胞可为来源于至少 一种具有以下情况的组织的细胞：由衰老引起的变性关节炎；由关节超负荷 (包含肥胖)引起的早期变性关节炎；由运动、跌倒、事故等引起的外部损伤； 由未适当治疗由外部损伤引起的软骨损伤继发性发展的变性关节炎；和由韧 带损伤、关节周围的肌肉无力、关节脱位、关节鼠形成和骨生长停滞引起的 关节变形。举例来说，接触TSP-2的细胞可为位于表达TSP-2的细胞的附近 的细胞。培养基可为细胞维持培养基或细胞的软骨形成诱导培养基。

根据本发明的另一实施例，提供一种减少软骨细胞死亡的组合物，所述 组合物包含肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和表达HB-EGF的干细胞。

HB-EGF可通过结合于erb类的EGF受体(EGFR)来发挥其生物活性。 HB-EGF以高亲和性结合肝素。HB-EGF结合于EGFR以调节生长因子对靶 细胞的生物作用，包含细胞迁移和增殖。HB-EGF可具有RefSeq NP_001936 (人类)(SEQ ID NO：7)或NP_034545(小鼠)(SEQ ID NO：8)中揭示的 氨基酸序列或来源于其的序列。

组合物可包含表达HB-EGF的干细胞。干细胞可为UCB-MSC。组合物 可包含载剂。已提供有关载剂的详细描述。

根据本发明的另一实施例，提供一种减少个体的软骨细胞死亡的方法， 所述方法包含向个体投予用于减少软骨细胞死亡的组合物，所述组合物包含 足以减少软骨细胞死亡的量的HB-EGF和表达HB-EGF的干细胞。

足以减少软骨细胞死亡的量是指足以使软骨细胞死亡的减少大于对照组 的量。举例来说，足以减少软骨细胞死亡的量是指足以使软骨细胞死亡的减 少比对照组多至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的量。 已提供有关组合物的详细描述。所述个体可为具有软骨损伤、软骨退化、软 骨损失或软骨缺损的个体。软骨的损伤、退化、损失或缺损可包含关节炎、 骨质疏松症、骨折或关节变形。关节炎可为风湿性关节炎或变性关节炎。软 骨的损伤、退化、损失或缺损可来源于选自由以下组成的群组的至少一个： 由衰老引起的变性关节炎；由关节超负荷(包含肥胖)引起的早期变性关节 炎；由运动、跌倒、事故等引起的外部损伤；由未适当治疗由外部损伤引起 的软骨损伤继发性发展的变性关节炎；和由韧带损伤、关节周围的肌肉无力、 关节脱位、关节鼠形成和骨生长停滞引起的关节变形。另外，软骨细胞可为 来源于至少一种受软骨的损伤、退化、损失或缺损影响的组织，例如如滑液、 骨膜、骨和骨髓等组织的细胞。投予过程可通过静脉内注射或肌肉注射来进 行，或可在病变部位上局部进行。个体可为哺乳动物。哺乳动物可包含人类、 母牛、猪、狗和小鼠。

组合物可进一步包含载剂。载剂可为培养基、缓冲液或生物相容性聚合 物。所述生物相容性聚合物可选自可在二维或三维结构下支撑细胞和/或维持 细胞活性的常用聚合物。生物相容性聚合物可包含至少一种选自由透明质酸、 羟基磷灰石、壳聚糖、纤维蛋白和胶原蛋白组成的群组的聚合物。所述方法 可在活体外或活体内进行。

根据本发明的另一实施例，提供一种增加干细胞对至少一种选自由 TSP-1、TSP-2、IL-17BR和HB-EGF组成的群组的蛋白质的表达的方法，所 述方法包含在患有至少一种选自由软骨损伤、软骨退化、软骨损失、软骨缺 损和其组合组成的群组的疾病的患者的关节液存在下培养干细胞。

所述干细胞可为BM-MSC或UCB-MSC。表达可在蛋白质或mRNA水平 上测量。干细胞相对于关节液来说可为同种异体或自体的。

至少一种选自由软骨损伤、软骨退化、软骨损失、软骨缺损和其组合组 成的群组的疾病可包含关节炎和关节变形。关节炎可为风湿性关节炎或变性 关节炎。疾病可包含选自由以下组成的群组的至少一个：由衰老引起的变性 关节炎；由关节超负荷(包含肥胖)引起的早期变性关节炎；由运动、跌倒、 事故等引起的外部损伤；由未适当治疗由外部损伤引起的软骨损伤继发性发 展的变性关节炎；和由韧带损伤、关节周围的肌肉无力、关节脱位、关节鼠 形成和骨生长停滞引起的关节变形。方法可在活体外或活体内进行。关节液 可为存在于患有上述疾病的组织自身中和受软骨损伤、软骨退化、软骨损失 或软骨缺损影响的组织中的细胞。存在于具有软骨损伤、软骨退化、软骨损 失或软骨缺损的组织中的细胞可为存在于组织自身和受软骨损伤、软骨退化、 软骨损失或软骨缺损影响的组织中的细胞。受影响的组织可视软骨损伤、软 骨退化、软骨损失或软骨缺损的程度而变化。举例来说，所述组织可选自由 滑液、骨膜、骨和骨髓组成的群组。另外，关节液可为位于患有疾病的个体 的任意位置的关节液。

根据本发明的另一实施例，提供一种使干细胞分化为病变组织细胞的方 法，所述方法包含在病变组织存在下培养干细胞。

病变组织可为关节炎患者的关节液；来源于关节炎患者的关节腔的滑 液；急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome；ARDS)、支 气管哮喘、肺癌、间质性肺病或慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary  disease；COPD)患者的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid； BALF)；或从患者收集的脊髓液、胸膜液、腹水液或胃液。培养过程可使用 所属领域中已知的与培养干细胞有关的方法来进行。

方法可进一步包含向具有病变组织的个体投予通过培养过程获得的分化 为病变组织细胞的干细胞(例如MSC)以治疗所述病变组织。病变组织和干 细胞(例如MSC)可彼此为同种异体或自体的。

在所述方法中，干细胞可包含选自由iPS细胞、胚胎干细胞和成人干细 胞组成的群组的至少一个。成人干细胞可选自由MSC、脂肪来源干细胞、内 皮干细胞和造血干细胞组成的群组。MSC可来源于哺乳动物，例如人类。 MSC可包含选自由以下组成的群组的至少一个：BM-MSC、UCB-MSC、脂 肪来源MSC、胚胎卵黄囊来源MSC、胎盘来源MSC、皮肤来源MSC、周边 血液来源MSC、肌肉来源MSC、肝脏来源MSC、神经组织来源MSC、骨膜 来源MSC、脐带来源MSC、胎膜来源MSC、滑膜来源MSC、羊膜来源MSC、 半月板来源MSC、前十字韧带来源MSC、关节软骨细胞来源MSC和从包含 MSC的其它组织分离和/或培养的MSC。方法可在活体外或活体内进行。

根据本发明的另一方面，提供一种筛选调节干细胞活性的物质的方法， 所述方法包含在病变组织存在下培养干细胞；和从培养物中测量所表达的产 物。

所述方法包含在病变组织存在下培养干细胞(例如MSC)。病变组织可 为关节炎患者的关节液；来源于关节炎患者的关节腔的滑液；急性呼吸窘迫 综合征(ARDS)、支气管哮喘、肺癌、间质性肺病或慢性阻塞性肺病(COPD) 患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)；或从患者收集的脊髓液、胸膜液、腹水 液或胃液。培养可在干细胞(例如MSC)的维持培养基或干细胞(例如MSC) 分化为对应于病变组织的组织的分化培养基存在下进行。以细胞悬浮液体积、 细胞浓度或细胞数目计，病变组织可以范围为5％到30％、例如10％到20％ 的量包含在培养物中。培养过程可使用所属领域中已知的与培养干细胞有关 的方法来进行。

在所述方法中，干细胞可包含选自由iPS细胞、胚胎干细胞和成人干细 胞组成的群组的至少一个。成人干细胞可选自由MSC、脂肪来源干细胞、内 皮干细胞和造血干细胞组成的群组。MSC可来源于哺乳动物，例如人类。 MSC可包含选自由以下组成的群组的至少一个：BM-MSC、UCB-MSC、脂 肪来源MSC、胚胎卵黄囊来源MSC、胎盘来源MSC、皮肤来源MSC、周边 血液来源MSC、肌肉来源MSC、肝脏来源MSC、神经组织来源MSC、骨膜 来源MSC、脐带来源MSC、胎膜来源MSC、滑膜来源MSC、羊膜来源MSC、 半月板来源MSC、前十字韧带来源MSC、关节软骨细胞来源MSC和从包含 MSC的其它组织分离和/或培养的MSC。方法可在活体外或活体内进行。

所述方法包含从培养物中测量所表达的产物。测量可使用已知方法来进 行。举例来说，当产物是RNA时，测量可通过定量PCR来进行。另一方面， 当产物是蛋白质时，测量可通过ELISA来进行。产物可为RNA或蛋白质。

所述方法可包含从所测量的产物中鉴别调节干细胞活性(例如MSC活 性)的物质。干细胞(例如MSC)的活性可为分化活性。方法可进一步包括 比较所测量的产物的量与通过对照实验获得的产物的量。对照实验可为阴性 或阳性对照实验。对照实验可通过不使用病变组织或在正常组织而非病变组 织存在下培养干细胞(例如MSC)并从培养物中测量所表达的产物来进行。

所述方法可包含，当产物的量大于对照组时，确定病变组织正面调节干 细胞活性(例如MSC活性)。所述方法可包含，当产物的量小于对照组时， 确定病变组织负面调节干细胞活性(例如MSC活性)。分化可为分化为对应 于病变组织的组织。举例来说，当病变组织是关节液时，其可分化为软骨细 胞。

根据本发明的另一实施例，提供一种增加干细胞对选自由TSP-2和 HB-EGF组成的群组的至少一个的表达的方法，所述方法包含团块培养干细 胞。

干细胞的团块培养可在干细胞三维聚集的状态下进行。举例来说，团块 培养可通过离心含有细胞的悬浮液以形成沉淀的细胞团块并培养所述团块来 进行。就此而言，用于培养的初始细胞浓度可为每毫升5×10⁵个细胞到每毫 升5×10⁷个细胞。离心过程可在350g到1500g下进行5分钟到30分钟。干 细胞可选自由iPS细胞、胚胎干细胞和成人干细胞组成的群组。成人干细胞 可选自由MSC、脂肪来源干细胞、内皮干细胞和造血干细胞组成的群组。 MSC可来源于哺乳动物，例如人类。MSC可包含选自由以下组成的群组的 至少一个：BM-MSC、UCB-MSC、脂肪来源MSC、胚胎卵黄囊来源MSC、 胎盘来源MSC、皮肤来源MSC、周边血液来源MSC、肌肉来源MSC、肝脏 来源MSC、神经组织来源MSC、骨膜来源MSC、脐带来源MSC、胎膜来源 MSC、滑膜来源MSC、羊膜来源MSC、半月板来源MSC、前十字韧带来源 MSC、关节软骨细胞来源MSC和从包含MSC的其它组织分离和/或培养的 MSC。

有利作用

根据本发明的一实施例，包含TSP-2的组合物可刺激细胞(例如MSC) 分化为软骨细胞。

根据本发明的一个或一个以上实施例，提供一种通过使用TSP-1、TSP-2 或IL-17BR来鉴别细胞(例如MSC)分化为软骨细胞的能力的方法，由此可 有效地鉴别MSC的软骨分化能力。

根据本发明的一个或一个以上实施例，提供一种通过使用TSP-1、TSP-2 或IL-17BR来使细胞(例如MSC)分化为软骨细胞的方法，由此可有效地使 所述细胞(例如MSC)分化为软骨细胞。

根据本发明的一实施例，提供一种使细胞(例如MSC)分化为病变组织 细胞的方法，由此可有效地使所述细胞(例如MSC)分化为病变组织细胞。

根据本发明的一实施例，提供一种筛选调节细胞活性(例如MSC活性) 的物质的方法，由此可有效地筛选调节所述细胞活性(例如MSC活性)的物 质。

附图说明

图1说明显示分别使在分化培养基中培养4周的7种类型脐带血间质干 细胞(UCB-MSC)，即C1、C2、C3、C4、C5、C6和C7分化的结果的图像。

图2是显示在软骨分化培养基中培养的UCB-MSC的凝血栓蛋白2 (TSP-2)的mRNA的表达量的图。

图3和图4是显示通过酶联免疫吸附分析(ELISA)获得的培养物上清 液中的TSP-2的量的图。

图5说明显示在TSP-2存在或不存在下培养的UCB-MSC的团块大小的 图像。

图6是显示在于软骨分化培养基中培养的6种类型UCB-MSC各自的培 养物上清液中表达的TSP-2的图。

图7说明显示UCB-MSC和骨髓间质干细胞(BM-MSC)的活体外软骨 分化的图像。

图8是显示UCB-MSC和BM-MSC分化为软骨谱系的能力的图。

图9说明显示根据本发明的一实施例在软骨分化诱导后第六周分析的10 种类型BM-MSC和10种类型UCB-MSC的软骨分化的图像。

图10说明显示在软骨分化诱导后第六周的UCM-MSC与BM-MSC之间 的软骨形成能力差异的图像。

图11是显示在单层和团块培养条件下在生长因子组合存在下TSP-2的表 达结果的图。

图12是显示根据UCB-MSC类型的TSP-2的表达水平的图。

图13是显示通过团块培养C3UCM-MSC和C5UCM-MSC 3天所获得的 TSP-2的表达量的测量结果的图。

图14说明显示在分化和去分化条件下UCB-MSC表达的TSP-2的量的 图。

图15到图17是显示在TSP-2存在下培养的UCB-MSC的标志蛋白质的 表达量的图。

图18说明显示在软骨培养基中在TSP-2表达抑制条件下培养的 UCB-MSC的软骨分化程度的图。

图19是显示正常人和骨关节炎患者的血浆中TSP-2的水平的图。

图20和图21是显示在关节炎患者的关节液存在下UCB-MSC的TSP-1 的表达量的图。

图22是显示通过实时聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction； RT-PCR)分析通过将分化为软骨的UCB-MSC溶解所获得的白细胞介素17B 受体(IL-17BR)的mRNA量的结果的图。

图23说明显示在关节炎患者的关节液存在下培养的UCB-MSC中肝素结 合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)的mRNA的测量结果的图。

图24是显示在软骨细胞死亡条件下培养的UCB-MSC中HB-EGF的表达 量的图。

图25说明显示在HB-EGF存在下培养的兔来源软骨细胞的观察结果的图 像。

图26是显示团块培养UCB-MSC和BM-MSC的结果的图。

具体实施方式

现将参考以下实例来更全面地描述本发明。这些实例仅出于说明性目的 且不企图限制本发明的范围。

实例1：鉴别由关节炎患者的关节液在UCB-MSC中特异性诱导的分泌 性蛋白质

为鉴别由UCB-MSC产生的调节软骨再生和软骨发炎的物质，将关节炎 患者的关节液加入培养UCB-MSC的培养基中以达到20％(v/v)的最终浓度， 接着进一步培养所得产物3小时。使用所获得的培养物上清液作为分析样品。 另外，使用在不加关节液的状态下培养的UCB-MSC培养物和/或未培养 UCB-MSC且包含20％(v/v)关节液的培养基作为对照组。从变性关节炎患 者获得关节液。

用可检测标志物标记预期包含于每一获得的培养物或对照样品中的蛋白 质。所述标志物是生物素，并通过荧光检测通过生物素与标记荧光的抗生蛋 白链菌素之间的特异性结合所形成的复合物来检测生物素。接着，根据制造 商的指导，用各样品处理上面固定有分别结合于507种分泌性蛋白质的抗体 的蛋白质芯片(瑞博奥科技公司(RayBiotech，Inc.)，RayBio^TM基于生物素 标记的人类抗体阵列I；目录号AAH-BLG-1-2)以同时反应。反应后，使用 激光扫描器(艾松吉皮斯扫描器(Axon Genepix scanner)4000B)将532纳 米的激发光照射于蛋白质芯片并在635纳米下检测放射光。通过比较所获得 的检测信号与从对照组获得的参考检测信号，可确定样品中各蛋白质的浓度。

作为分析结果，当UCB-MSC在关节炎患者的关节液存在下培养时，与 UCB-MSC在关节炎患者的关节液不存在下培养的情况相比，TSP-1、TSP-2、 IL-17BR和HB-EGF显著增加。

实例2：UCB-MSC软骨分化与TSP-2的关联

在本实例中，评估UCB-MSC软骨分化与TSP-2的关联。另外，评估TSP-2 是否诱导UCB-MSC分化为软骨细胞。

1)各类型UCB-MSC的软骨分化能力

首先，证实各种类型UCB-MSC的软骨分化能力。在软骨分化培养基中 团块培养各类型的UCB-MSC。软骨分化培养基是含有50微克/毫升抗坏血酸 盐、0.1微摩尔浓度地塞米松、40微克/毫升L-脯氨酸、100微克/毫升丙酮酸 盐、10纳克/毫升TGF-β3、500纳克/毫升BMP-6、50毫克ITS+/毫升和50微 克/毫升庆大霉素的高葡萄糖DMEM。初始细胞浓度是每毫升5×10⁵个细胞， 且培养在15毫升聚丙烯管中进行4周。每周更换培养基两次，且用含于石蜡 中的4％多聚甲醛固定团块，并切割成5微米厚的片状物。用番红-O (Safranin-O)将所述片状物染色以检测阴离子蛋白聚糖。

图1显示根据本发明的一实施例分别使在分化培养基中培养4周的7种 类型UCB-MSC，即C1、C2、C3、C4、C5、C6和C7分化的结果的图像。 参看图1，证实归类为具有良好软骨分化能力的C1和C2各具有具圆形腔隙 的横截面，其中清晰的边界令人满意地完全形成于腔隙上。就此而言，腔隙 是证实软骨存在的标志物。另外，归类为具有中等软骨分化能力的C3和C4 各具有具小腔隙的横截面，其中清晰的边界完全或部分形成于腔隙上。在归 类为具有不良软骨分化能力的C5、C6和C7的情况下，几乎不形成腔隙结构。 此表明UCB-MSC由于个体间的遗传差异和收集脐带血过程中的差异而具有 不同分化能力。

(2)软骨分化能力与TSP-2的关联

在软骨分化培养基中培养具有不同软骨分化能力的各类型UCB-MSC1 周，并通过实时-PCR(RT-PCR)，使用总RNA作为模板并使用TSP-2特异 性引物，从培养的细胞中测量TSP-2的mRNA量。

图2是显示根据本发明的一实施例在软骨分化培养基中培养的 UCB-MSC的TSP-2的mRNA的表达量的图。参看图2，TSP-2在具有高软 骨分化能力的C1(或C2)UCB-MSC中表达量最大，而TSP-2在具有低软骨 分化能力的C5(C6或C7)UCB-MSC中的表达较弱。

另外，在软骨分化培养基中培养具有软骨分化能力的UCB-MSC各类型， 并根据时间，通过ELISA分析所获得的培养物上清液中TSP-2的浓度。

图3和图4是显示根据本发明的实施例通过ELISA获知的培养物上清液 中TSP-2的量的图。参看图3和图4，TSP-2在具有高软骨分化能力的C1或 C2UCB-MSC中的表达水平高(参看图3)，而TSP-2在C5、C6或C7UCB-MSC 中的表达水平极低(参看图4)。

(3)TSP-2诱导软骨分化的活性

在含有10纳克/毫升分离并纯化的人类TSP-2蛋白质(美国明尼苏达州 明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D System，Minneapolis，MN，USA))的 软骨分化培养基中团块培养UCB-MSC，并测量其团块大小。因为UCB-MSC 分化为软骨细胞，所以细胞外基质(ECM)的合成增加，因此团块大小表示 软骨分化程度。

图5是显示根据本发明的一实施例在TSP-2存在或不存在下培养的 UCB-MSC的团块大小的图像。在图5中，对照组的团块大小是258526.070 平方微米，且当使用含有10纳克/毫升TSP-2的软骨分化培养基时，团块大 小是对照组的3.49倍，即901919.431平方微米。如图5中所说明，UCB-MSC 的团块大小因TSP-2而增加，此表明TSP-2诱导软骨分化。

实例3：根据软骨分化能力的TSP-2的表达水平

在本实例中，测量UCB-MSC根据其软骨分化能力的TSP-2的表达水平。 首先，在软骨分化培养基中在相同条件下分别培养C3、C4和C5UCB-MSC 7 天以诱导软骨分化。C3、C4和C5UCB-MSC的相对软骨分化能力先前已经 通过实验证实，并满足C3＞C4＞C5的情况。接着，通过ELISA测量所获得 的培养物上清液中的TSP-2。

图6是显示根据本发明的一实施例在于软骨分化培养基中培养的3种类 型UCB-MSC各自的培养物上清液中表达的TSP-2的图。参看图6，归类为 具有最低软骨分化能力的C5UCB-MSC在软骨分化诱导前的状态(未处理状 态)下分泌每1×10⁵个细胞72皮克/毫升TSP-2，在软骨分化诱导后第三天分 泌每1×10⁵个细胞1.2纳克/毫升TSP-2，且在软骨分化诱导后第七天分泌每 1×10⁵个细胞0.550纳克/毫升TSP-2。因此，可选择表达TSP-2的量大于C5 UCB-MSC表达的TSP-2的UCB-MSC作为适合用于软骨分化的UCB-MSC。

实例4：UCB-MSC和BM-MSC的软骨形成能力

使用各来源于约10位不同人类供体的UCB-MSC和BM-MSC进行活体 外软骨形成实验。

(1)制备UCB-MSC和BM-MSC

在告知产妇同意的情况下，从分娩的脐静脉获得脐带血(UCB)样品。 在各供体同意的情况下，从各供体的髂嵴获得骨髓抽出物。通过相同方法从 人类BM和UCB分离出粘附(adherent)和纺锤形间质干细胞(MSC)样单核 细胞。证实从两种来源获得的粘附和纺锤形MSC样单核细胞的以下性质： (1)干细胞性(增殖性)、(2)粘附、(3)纺锤形、(4)细胞表面抗原(使 用流式细胞仪证实)，和分化为例如骨和软骨等间质组织的能力。

经证实满足要求(1)到(3)的从两种来源获得的粘附和纺锤形MSC样 单核细胞的细胞表面抗原表型对CD14、CD34和CD45(造血标志物)和 HLA-DR(II型标志物)呈阴性，而其对CD29、CD44、CD73、CD105和CD90 (MSC标志物)和HLA-ABC(I型标志物)呈阳性。因为纤维母细胞也表达 与上文所述相同的一组表面抗原且是粘附、纺锤形、增殖性细胞，所以进一 步证实MSC样单核细胞的性质以证实MSC适当分化为例如骨和软骨等间质 组织的潜能。

(2)证实各类型MSC的软骨分化能力和性质

在软骨分化培养基中团块培养BM-MSC或UCB-MSC 6周以诱导软骨形 成。使用补充有500纳克/毫升骨形态生成蛋白-6(BMP-6)(美国明尼苏达 州明尼阿波利斯的R&D系统公司)、10纳克/毫升转化生长因子-β3(TGFβ3) (西格玛公司(Sigma))、ITS+预混物(6.25微克/毫升胰岛素、6.25微克/ 毫升转铁蛋白、6.25纳克/毫升亚硒酸、1.25毫克/毫升BSA和5.35毫克/毫升 亚油酸，1∶100稀释，碧迪公司(Becton Dickinson))、100纳摩尔浓度地塞 米松(西格玛公司)、50微克/毫升抗坏血酸盐-2-磷酸酯、40微克/毫升L- 脯氨酸(西格玛公司)和100微克/毫升丙酮酸盐(西格玛公司)的高葡萄糖 杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)作为软骨分化培养基。软骨形成领域的技 术人员通常使用此软骨分化培养基(参见“团块培养(Pellet Culture)”，国家 科學院院刊的材料与方法(Materials and Methods of PNAS)，第99卷，第7 期，第4397-4402页(2002)；“软骨形成(Chondrogenesis)”，干细胞的材料与 方法(MATERIALS AND METHODS of Stem cells)，20(2002)：530-41)。已 知UCB-MSC和BM-MSC容易分化为软骨细胞。

用胰蛋白酶分离传代4到6次的MSC，接着在软骨分化培养基中悬浮到 每毫升5×10⁵个。然后，将悬浮液加入15毫升聚丙烯管中，并在500g下离 心MSC 5分钟以形成团块。培养所获得的团块。每周更换培养基两次，且根 据时间，用含于石蜡中的4％多聚甲醛固定团块，并切割成5微米厚的片状物。 用番红-O将所述片状物染色以检测阴离子蛋白聚糖。另外，使片状物经受II 型胶原蛋白免疫染色。根据是否在团块培养中形成具有圆形形状的团块，通 过番红-O或苏木精(Hematoxylin)复染时是否存在软骨特异性蛋白聚糖，以 及II型胶原蛋白免疫染色时是否存在II型胶原蛋白来确定软骨分化。

图7说明显示根据本发明的一实施例UCB-MSC和BM-MSC的活体外软 骨分化的图像。在图7中，团块a、c和e分别表示活体外软骨形成后1周(a)、 3周(c)和6周(e)所获得的UCB-MSC的番红-O染色结果，且团块b、d 和f分别表示活体外软骨形成后1周(b)、3周(d)和6周(f)所获得的 BM-MSC的番红-O染色结果。另外，g和h分别表示活体外软骨形成后6周 所获得的UCB-MSC和BM-MSC的II型胶原蛋白免疫染色结果。

番红-O特异性橙红色染色在活体外软骨形成后6周所获得的UCB-MSC 中比在活体外软骨形成后6周所获得的BM-MSC中明显(参看e和f)。另 外，II型胶原蛋白免疫染色(图7中箭头指示)在活体外软骨形成后6周所 获得的UCB-MSC中比在活体外软骨形成后6周所获得的BM-MSC中明显 (参看g和h)。

软骨形成诱导后1周，UCB-MSC和BM-MSC未显示番红-O特异性橙红 色染色的明显差异。软骨形成诱导后3周，BM-MSC未显示任何软骨形态， 而UCB-MSC开始展现软骨细胞形态。即，在UCB-MSC的情况下，在团块 外观察到软骨膜样细胞，细胞外基质开始在团块内分泌，且UCB-MSC开始 对番红-O染色呈弱阳性。软骨形成诱导后6周，BM-MSC显示与3周 UCB-MSC相同的软骨形成程度，而UCB-MSC显示典型的软骨形成组织形 态。为证实是否形成具有功能的正常软骨细胞，进行II型胶原蛋白免疫染色， 结果，可观察到棕色阳性染色，如图7中箭头所指示。比较UCB-MSC与 BM-MSC，UCB-MSC展现阳性大于BM-MSC，此表明UCB-MSC具有更好 的软骨形成能力。

总之，如图6中所说明，UCB-MSC的软骨形成能力显著优于BM-MSC。

图8是显示根据本发明的一实施例UCB-MSC和BM-MSC分化为软骨谱 系的能力的图。如下进行确定UCB-MSC和BM-MSC分化为软骨谱系的能力 的实验。首先，用胰蛋白酶分离传代4到6次的MSC，接着在软骨分化培养 基中悬浮到每毫升5×10⁵个细胞。然后，将悬浮液加入15毫升聚丙烯管中， 并在500g下离心MSC 5分钟以形成团块。培养所获得的团块。每周更换培 养基两次。

参看图8，10个UCB-MSC样品中有7个(70％)具有分化为软骨谱系 的能力，而10个BM-MSC样品中有5个(50％)具有分化为软骨谱系的能 力。软骨分化后6周，UCB-MSC的团块面积大小(n＝7，1450123.7±24256.9 平方微米)(p＜0.02)比BM-MSC的团块面积大小(n＝5，346531.3±87396.6 平方微米)大得多。通过艾搜软件(i-solution software)(大田广域市斗山的 IM技术公司(IM Technology，Doosan，Daejeon))测量团块面积和对番红-O 呈阳性的面积。

图9说明显示根据本发明的一实施例在软骨分化诱导后第六周分析的10 种类型BM-MSC和10种类型UCB-MSC的软骨分化的图像。参看图9，番 红-O的软骨蛋白聚糖特异性橙红色染色在7种类型UCB-MSC中明显(A图 -上图中的7个和下图中的2个)，而在5种类型BM-MSC中明显(B图-上 图中的5个)。也就是说，全部类型UCB-MSC中70％分化为软骨谱系，而 全部类型BM-MSC中仅50％分化为软骨谱系。

图10说明显示根据本发明的一实施例在软骨分化诱导后第六周 UCM-MSC与BM-MSC之间的软骨形成能力差异的图像。图10更清楚地显 示UCB-MSC产生的软骨团块与BM-MSC产生的软骨团块之间的差异，其中 在相同软骨形成条件下培养相同数目的UCB-MSC和BM-MSC 6周。参看图 9，UCB-MSC产生的软骨团块显然比BM-MSC产生的软骨团块大得多。另 外，与BM-MSC来源软骨团块中相比，软骨特异性蛋白聚糖基质在含有包围 腔隙的软骨细胞样细胞的UCB-MSC来源软骨团块中更丰富和清晰。此表明 在相同活体内软骨形成条件下UCB-MSC的软骨形成能力优于BM-MSC。

这些结果证实UCB-MSC的软骨分化能力在统计学上显著高于 BM-MSC。归因于所述事实，MSC可具有显著不同的差异细胞特征，尽管都 称为MSC。即，此表明相同MSC也可归类为不同细胞类型。在本发明实施 例中，进行分化测试以测试MSC细胞类型的差异，其中分化视以下而定：(1) MSC不同于终末分化的纤维母细胞的特性(identity)和(2)尤其是分离出各类 型MSC的源组织的来源和年龄。

对于UCB-MSC和BM-MSC使用相同软骨形成培养基。另外，引入培养 基中所含的生长因子组合以用于BM-MSC的软骨形成且为所属领域所熟知 (生物化学与生物物理学研究通讯(Biochemical and Biophysical Research  Communications)320(2004)：第914-919页的摘要，材料与方法的“细胞培养” 与“团块培养”(″Cell culture″and″Pellet culture″of Materials and Methods))。 因此，本发明实施例中所用的特定培养基条件优选不会影响UCB-MSC的软 骨能力。总之，UCB-MSC的活体外软骨活性优于BM-MSC。

实例5：鉴别TSP-2在UCB-MSC中表达的诱导剂

在本实例中，通过改变培养条件来鉴别TSP-2在UCB-MSC中表达的诱 导剂。

首先，用胰蛋白酶处理单层培养的UCB-MSC以进行分离，且在无血清 DMEM中悬浮到每毫升5×10⁵个细胞的浓度，并培养所得产物24小时。所用 培养基是DMEM(含有100纳摩尔浓度地塞米松、50微克/毫升抗坏血酸盐 -2-磷酸酯、40微克/毫升L-脯氨酸和100微克/毫升丙酮酸盐)和补充有选自 10纳克/毫升TGF-β3(西格玛公司)、500纳克/毫升BMP-6(美国明尼苏达 州明尼阿波利斯的R&D系统公司)和ITS+(6.25微克/毫升胰岛素、6.25微 克/毫升转铁蛋白、6.25微克/毫升亚硒酸、1.25毫克/毫升BSA和5.35毫克/ 毫升亚油酸，1∶100稀释，碧迪公司)的生长因子的DMEM。UCB-MSC单层 培养或团块培养。在团块培养的情况下，悬浮液在500g下离心5分钟以形 成细胞团块，并培养所获得的细胞团块。

收集所获得的培养物上清液后，获得细胞溶解物，并通过使用实时聚合 酶链反应(RT-PCR)，使用从细胞溶解物提取的总RNA作为模板，测量 UCB-MSC的TSP-2的mRNA水平。

图11是显示根据本发明的一实施例在单层培养和团块培养条件下在生 长因子组合存在下TSP-2的表达结果的图。参看图11，TSP-2的表达在团块 培养条件下显著增加。另外，从图11中所说明的结果证实，生长因子不会影 响TSP-2的表达。

实例6：适合用于软骨形成的细胞类型的选择

在不诱导软骨形成的培养基中培养UCB-MSC，并证实TSP-2的表达量 是否与UCB-MSC的软骨分化能力相关。

具体来说，在无血清DMEM(含有100纳摩尔浓度地塞米松、50微克/ 毫升抗坏血酸盐-2-磷酸酯、40微克/毫升L-脯氨酸和100微克/毫升丙酮酸盐) 中将C3和C5UCB-MSC单层培养和团块培养到每毫升5×10⁵个细胞的浓度。 培养条件与实例5中的培养条件相同。通过ELISA测量所获得的培养物上清 液中TSP-2的表达量。另外，BM-MSC的培养条件也与UCB-MSC的培养条 件相同。

图12是显示根据本发明的一实施例，根据UCB-MSC的类型的TSP-2的 表达程度的图。在图12中，C3和C5表示UCB-MSC细胞类型，且未处理和 团块分别表示单层培养24小时和团块培养24小时。在培养过程期间和培养 过程后C3和C5的光学显微镜观察结果与图1的C3和C5的结果相同。

参看图12，单层培养的C5(未处理)表达每1.0×10⁵个细胞33到72皮 克/毫升TSP-2，而团块培养的C5(团块)表达每1.0×10⁵个细胞163到550 皮克/毫升TSP-2。先前证实C3UCB-MSC的软骨形成能力优于C5UCB-MSC。 因此，细胞是否具有高软骨形成能力可通过比较细胞的TSP-2表达量与参考 细胞(例如C5UCB-MSC)的TSP-2表达量来确定。举例来说，当1天单层 培养(未处理)的参考细胞表达TSP-2的量高于每1.0×10⁵个细胞33到72 皮克/毫升时，或当1天团块培养的参考细胞表达TSP-2的量高于每1.0×10⁵ 个细胞163到550皮克/毫升时，可确定参考细胞的软骨形成能力高于C5 UCB-MSC。所述方法可用于选择适合用于软骨形成的MSC。

基于选择适合用于软骨形成的细胞的标准，所属领域的技术人员可适当 选择参考细胞。

如图12中所说明，当团块培养干细胞时，TSP-2的表达显著增加。

图13是显示根据本发明的一实施例通过团块培养C3UCM-MSC和C5 UCM-MSC 3天所获得的TSP-2的表达量的测量结果的图。参看图13，具有 低软骨分化能力的C5UCM-MSC的TSP-2的表达量小于具有高软骨分化能力 的C3UCM-MSC，即使增加培养时间也是如此。

因此，TSP-2的表达量与UCB-MSC的软骨分化能力相关，并可通过测 量TSP-2的表达量来预计MSC的软骨分化能力。

图26是显示根据本发明的一实施例团块培养UCB-MSC和BM-MSC后 TSP-2的表达水平的测量结果的图。参看图26，UCB-MSC表达TSP-2的水 平显著高于BM-MSC。此表明UCB-MSC的软骨分化程度优于BM-MSC。

图26中所说明的结果如下获得。首先，用胰蛋白酶处理单层培养的 UCB-MSC和BM-MSC以进行分离，且在无血清DMEM中将UCB-MSC和 BM-MSC各悬浮到每毫升5×10⁵个细胞的浓度，并培养24小时。所用培养基 是DMEM(含有100纳摩尔浓度地塞米松、50微克/毫升抗坏血酸盐-2-磷酸 酯、40微克/毫升L-脯氨酸和100微克/毫升丙酮酸盐)。团块培养各细胞， 并在500g下离心5分钟以形成细胞团块，且培养所获得的细胞团块24小时。 收集所获得的培养物上清液，并通过ELISA测量TSP-2的表达水平。

实例7：在软骨分化和去分化条件下UCB-MSC对TSP-2的表达

为证实TSP-2的表达量与软骨分化的关联，在软骨分化和去分化条件下 测量UCB-MSC表达TSP-2的量。

(1)在软骨分化条件下软骨形成祖细胞对TSP-2的表达

从小鼠胚胎的肢芽上分离软骨形成祖细胞。将每毫升4×10⁷个细胞的分 离的软骨形成祖细胞再悬浮于培养基(含有DMEM/F-12(2∶3)、10％(v/v) FBS、50微克/毫升链霉素(streptomycin)和每毫升50个单位的青霉素 (penicillin))中，且将各15微升再悬浮的软骨形成祖细胞滴入培养皿中， 以非依赖性斑点形态附着于其上。接着，培养呈斑点形态的软骨形成祖细胞 6天以诱导各斑点分化为软骨细胞。通过使用RT-PCR，使用从细胞分离的总 RNA作为模板来测量TSP-2的表达量。

图14说明显示根据本发明的一实施例在分化和去分化条件下软骨形成 祖细胞或软骨细胞表达的TSP-2的量的图。参看图14的A，在分化条件下 TSP-2的表达量随培养时间而增加。

(2)在软骨去分化条件下软骨细胞对TSP-2的表达

从2周龄兔的膝关节分离软骨细胞。在含有DMEM、10％(v/v)FBS和 50微克/毫升庆大霉素的培养基中在5纳克/毫升白细胞介素-1β(IL-1β)存在 下培养分离的软骨细胞以诱导去分化。IL-1β是一种使软骨细胞去分化，从而 丧失软骨细胞性质的促发炎性细胞因子。通过RT-PCR，使用从细胞分离的 总RNA作为模板来测量TSP-2的表达量。

参看图14的B，在去分化条件下TSP-2的表达量随培养时间而减少。

从上述结果证实，TSP-2的表达与软骨细胞的软骨分化和去分化相关。

实例8：TSP-2对UCB-MSC的软骨分化诱导

在TSP-2存在下培养UCB-MSC以诱导软骨分化。所用培养基是上述软 骨形成培养基。将重组TSP-2(美国明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公 司)以10纳克/毫升到500纳克/毫升的量加入培养基中，并团块培养所得物。 UCB-MSC的初始浓度是每毫升5×10⁵个细胞。培养过程后，使用从细胞分离 的总RNA作为模板并使用对软骨细胞标志物(例如II型胶原蛋白(Col IIA1)、 聚集蛋白聚糖(Acan)、Sox-9和TSP-2)和肥大软骨细胞和骨标志物(例如 Col IA1和Col XA1)具有特异性的引物进行RT-PCR，以测量这些标志物的 mRNA的表达量。

图15到图17是显示根据本发明的实施例在TSP-2存在下培养的 UCB-MSC的标志蛋白质的表达量的图。参看图15到图17，软骨分化诱导后 1周，II型胶原蛋白(Col IIA1)、聚集蛋白聚糖(Acan)和Sox-9的表达视 其浓度而增加，而Col 1A1和Col XA1的表达减少或不随培养时间表现出来。

因此，证实外部加入的TSP-2刺激UCB-MSC的软骨分化。

实例9：在TSP-2表达抑制条件下UCB-MSC的软骨分化诱导

在软骨形成培养基中在TSP-2表达抑制条件下培养UCB-MSC以诱导软 骨分化。

将序列与TSP-2的mRNA序列互补的小干扰RNA(small interfering RNA； siRNA)(韩国大田广域市的柏业公司(Bioneer，Daejeon，Korea)，有义序 列：SEQ ID NO：9，反义序列：SEQ ID NO：10)以33纳摩尔浓度的浓度加入 培养基中以抑制TSP-2的表达。所用培养基是上述软骨形成培养基，并团块 培养UCB-MSC。UCB-MSC的初始浓度是每毫升5×10⁵个细胞，且培养过程 进行7天。通过使用RT-PCR，使用从UCB-MSC提取的总RNA并使用TSP-2 特异性引物来测量TSP-2的表达量，或通过ELISA测量所获得的培养物上清 液中TSP-2的表达量。通过使用RT-PCR测量Col IIA1和聚集蛋白聚糖的表 达。

图18说明显示根据本发明的一实施例在软骨形成培养基中在TSP-2表达 抑制条件下培养的UCB-MSC的软骨分化程度的图。参看图18，在于TSP-2 表达抑制条件下(即在TSP-2的siRNA存在下)培养的UCB-MSC中，软骨 细胞标志物(即Col IIA1和聚集蛋白聚糖)的表达显著减少。此表明TSP-2 诱导或刺激UCB-MSC的软骨分化。在图18中，A显示通过RT-PCR测量 TSP-2的浓度的结果，B显示通过ELISA测量TSP-2的浓度的结果，且C和 D分别显示Col IIA1和聚集蛋白聚糖的RT-PCR结果。

实例10：骨关节炎患者的血浆中TSP-2的水平

从15位正常人和28位骨关节炎患者收集血液，并通过ELISA测量各血 浆中TSP-2的水平。

图19是显示根据本发明的一实施例正常人和骨关节炎患者的血浆中 TSP-2的水平的图。参看图19，骨关节炎患者的血浆中TSP-2的水平高于正 常人的血浆。此表明血液中TSP-2的水平可充当诊断关节炎的标志物。此还 表明血液中TSP-2的水平可充当诊断关节炎的标志物外，还可充当诊断除关 节炎外的软骨分化相关疾病的标志物。

实例11：在关节炎患者的关节液下TSP-1在UCB-MSC中的表达

证实关节炎患者的关节液对TSP-1在UCB-MSC中表达的作用。

在关节炎患者的关节液存在下培养UCB-MSC。在含有MEM-α、10％(v/v) FBS和50微克/毫升庆大霉素的培养基中培养UCB-MSC 5到6天。当将 UCB-MSC培养到培养容器面积的70-80％的水平时，将关节腔的关节液加入 培养基中。在培养UCB-MSC的培养基更换为含有MEM-α和50微克/毫升庆 大霉素的培养基后，加入关节炎患者的关节液到20％(v/v)的浓度，且进一 步培养所得物3小时。使用所获得的培养物作为分析样品。另外，使用在不 加关节液的状态下培养的UCB-MSC培养物和/或未培养UCB-MSC且加入关 节液到20％(v/v)的浓度的培养基作为对照组。从变性关节炎患者获得关节 液。

图20和图21是显示根据本发明的实施例在关节炎患者的关节液存在下 UCB-MSC的TSP-1的表达量的图。在图20中，MSC仅表示在无关节液的情 况下培养UCB-MSC，且JF#1、JF#2和JF#3分别表示不同患者的关节液，和 来自一式三份实验的结果。在图20中，通过使用RT-PCR，使用从UCB-MSC 提取的总RNA作为模板并使用TSP-1特异性引物来测量TSP-1的表达量。

在图21中，JF表示关节炎患者的关节液。在图21中，通过ELISA测量 所获得的UCB-MSC培养物上清液中TSP-1的表达量。参看图21，在关节炎 患者的关节液存在下培养的UCB-MSC表达的TSP-1的量大于在不包含关节 炎患者的关节液的培养基中培养的UCB-MSC或仅包含20％关节炎患者的关 节液的培养基中获得的培养物。

实例12：IL-17BR与软骨分化能力的关联

在软骨分化培养基中团块培养具有不同软骨分化能力的UCB-MSC类型 1周以诱导软骨分化。通过使用RT-PCR，使用通过溶解UCB-MSC所获得的 总RNA作为模板来测量IL-17BR的mRNA量。

图22是显示根据本发明的一实施例通过RT-PCR分析通过溶解分化为软 骨的UCB-MSC所获得的IL-17BR的mRNA量的结果的图。

参看图22，根据UCB-MSC的软骨分化能力，IL-17BR的mRNA的表达 水平不同。即，C2和C3UCB-MSC表达IL-17BR的mRNA，且C2UCB-MSC 的软骨分化能力程度是C3UCB-MSC的8.9倍。另一方面，具有低软骨分化 能力的C5UCB-MSC不表达IL-17BR的mRNA。

实例13：关节炎患者的关节液对HB-EGF表达的作用

通过使用类似于实例1所用的方法，在加入关节炎患者的关节液到10％ (v/v)的浓度的培养基中培养UCB-MSC 6小时，并通过RT-PCR，使用从 UCB-MSC获得的总RNA作为模板来测量HB-EGF的mRNA量。作为对照 组，使用在上述相同条件下(除了培养基不包含关节炎患者的关节液)培养 的UCB-MSC。

图23说明显示根据本发明的一实施例在关节炎患者的关节液存在下培 养的UCB-MSC中HB-EGF的mRNA的测量结果的图。在图23中，C3和 C5表示UCB-MSC类型，BM-MSC表示骨髓来源间质干细胞，BEAS-2B表 示肺来源支气管上皮细胞，且JF表示关节液。参看图23，关节炎患者的关节 液使HB-EGF在UCB-MSC中的表达显著增加，而在BM-MSC和BEAS-2B 中并不明显。关节炎患者的关节液使UCB-MSC表达的HB-EGF的量是 BM-MSC中HB-EGF的2倍(C5UCB-MSC)到8.4倍(C3UCB-MSC)。

此表明在UCB-MSC中关节炎患者的关节液特异性诱导HB-EGF的表达。 此还表明UCB-MSC可表达的HB-EGF的量显著大于BM-MSC中HB-EGF 的量。

另外，测量UCB-MSC表达HB-EGF的程度和关节炎患者的关节液使 HB-EGF在UCB-MSC中表达的程度。就此而言，使用C3和C5UCB-MSC， 并使用从3位患者(JF1、JF5和JF11)收集的关节液。HB-EGF的培养条件 和测量条件与上文关于图20所述的相同。表1展示通过使用RT-PCR分析 UCB-MSC表达HB-EGF的程度和关节炎患者的关节液使HB-EGF在 UCB-MSC中表达的程度的结果。

<表1>

参看表1，当将UCB-MSC与关节炎患者的关节液一起培养时，其表达 的HB-EGF的量是对照组中HB-EGF的9.2倍到46.9倍。

实例14：在软骨细胞死亡条件下UCB-MSC对HB-EGF的表达

在软骨细胞死亡条件下分析UCB-MSC表达HB-EGF的程度。首先，从 2周龄兔的关节分离软骨细胞。在6孔盘中含有DMEM和10％(v/v)FBS 的培养基中培养分离的软骨细胞5天，且实验中使用所培养的软骨细胞。在 硝普钠(sodium nitroprusside；SNP)或兔来源软骨细胞存在下培养UCB-MSC 24小时。就此而言，在培养基中加入500微摩尔浓度SNP。SNP是一种产生 氧化氮的化合物，并已知其诱导软骨细胞死亡。加入SNP以在活体外模拟关 节炎患者中出现的条件。另外，分别在转膜室(transwell chamber)(美国加 利福尼亚州圣何塞的BD猎鹰公司(BD Falcon，San Jose，California，USA)， 用于6孔盘的细胞培养插入物，0.4微米，半透明PET膜)的下部部分和上 部部分中共培养兔来源软骨细胞和UCB-MSC。

通过进行免疫印迹，使得UCB-MSC从培养物分离并溶解，接着对于相 同浓度的溶解物使用标记萤光标志物的抗HB-EGF抗体和特异性结合于抗 HB-EGF抗体的抗体，来测量HB-EGF是否表达。

图24是显示根据本发明的一实施例在软骨细胞死亡条件下培养的 UCB-MSC中HB-EGF的表达量的图。参看图24，当在软骨细胞凋亡条件下 培养时，UCB-MSC不表达HB-EGF，而当与兔来源软骨细胞一起共培养时， UCB-MSC表达HB-EGF。

另外，在HB-EGF存在下培养兔来源软骨细胞，接着证实兔来源软骨细 胞是否得到保护。图25说明显示根据本发明的一实施例在HB-EGF存在下培 养的兔来源软骨细胞的观察结果的光学显微镜图像。参看图25，对照组(上 部部分)中的兔来源软骨细胞视SNP的浓度而死亡，而在含有50纳克/毫升 HB-EGF的培养基中培养的兔来源软骨细胞的凋亡视SNP的浓度而得到抑 制。此表明由SNP引起的兔来源软骨细胞凋亡被HB-EGF抑制。

本说明书中所包含的序列表是以引用的方式并入本文中。