京尼平改善高脂饮食诱导的高血脂症并降低肝脏脂质堆积的分子机制研究

摘要

近年来，随着社会的发展和人民生活水平的提高，人们的膳食结构和生活方式也随之改变，长期过多地摄入高热能的食物以及久坐少动的不良生活方式使人们体内积累过多的脂肪而导致肥胖。脂肪组织和其它器官如心脏、肝脏及骨骼肌中异常过量的脂肪堆积会导致代谢方面的脂毒性，造成慢性低程度的炎症反应和代谢功能紊乱，增加一系列慢性疾病的风险，如心血管疾病、高血压、血脂紊乱、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝以及癌症等。如何降低体重，减少肥胖相关的代谢紊乱的发生，是当下亟待解决的公共健康问题。京尼平是栀子的有效成分，常作为传统中药治疗糖尿病。但是，其是否能够改善营养过剩导致的高血脂症和脂肪肝，如何调控脂质代谢，目前尚不清楚。
　　本实验以高脂食物(high-fat diet，HFD)喂养的肥胖小鼠为研究对象，通过灌胃不同剂量的京尼平来分析其对营养过量导致的肥胖和代谢紊乱的影响。每周测量小鼠的体重和饮食量，并通过代谢笼系统检测小鼠的呼吸熵(respiratory quotient,RQ)、能量消耗(energy expenditure，EE)、耗氧量(oxygen consumption，VO2)和活动量，分析小鼠基础代谢指标。此外，检测小鼠血液和肝脏中脂质含量，确定其对脂质代谢的影响。同时，还可以通过免疫组化实验，观测小鼠肝脏中的脂滴储存情况。为了进一步探究京尼平调控脂质代谢的分子机制，我们检测了京尼平处理的小鼠和原代肝细胞中脂质代谢相关基因在mRNA和蛋白水平表达量的变化。并且对京尼平处理的原代肝细胞进行油红染色和甘油三脂(triglyceride，TG)含量测定，在功能上确认京尼平对脂质代谢的调控作用。因为小RNA(microRNAs，miRNAs)在调控脂质稳态中起重要作用，我们推测其在京尼平调控脂质代谢中也发挥重要作用。通过生物信息学分析了调控脂质基因表达的miRNAs，验证其对靶基因的调控作用，并检测其是否受京尼平的调控。并且通过荧光素酶报告系统实验，确定其靶向调控基因的序列。结合miRNAs mimic和inhibitor的转染实验，探究miRNAs在京尼平调控的脂质代谢中的介导作用。
　　我们的研究发现，在HFD喂食的肥胖小鼠中，京尼平可以剂量依赖性地降低小鼠体重，而对小鼠的饮食量没有影响。此外，代谢笼检测结果发现京尼平还能增加小鼠的VO2、EE和活动量。说明京尼平可能通过增加小鼠的能量代谢来降低体重。不仅如此，对京尼平可以显著性地降低肥胖小鼠血液和肝脏中脂质的含量，改善高血脂症并降低肝脏内脂质堆积。在分子水平上，我们检测了小鼠肝脏组织中参与脂质代谢基因的表达，发现京尼平在mRNA水平可以特异性地抑制脂质合成基因的表达。在分离的原代肝细胞中，京尼平也可以剂量依赖性地抑制游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)上调的脂质合成基因的表达。用生物信息学分析靶向Srebp-1c3;非转录区(untranslated regions，UTRs)的miRNAs，并经实验验证其受到京尼平的调控。结果发现，京尼平可以上调miR-142a-5p的表达。而且，荧光素酶报告系统实验结果显示，miR-142a-5p可以通过与，rebp-1c3'UTR中ACTTTATT序列结合而降低其活性，并且抑制其蛋白表达水平。在转染miR-142a-5p inhibitor的原代肝细胞中，京尼平不改变SREBP-1c的蛋白表达水平，对脂质堆积情况也没有影响，说明miR-142a-5p介导京尼平对SREBP-1c表达和脂质堆积的抑制作用。综上所述，京尼平在小鼠中通过miR-142a-5p/SREBP-1c途径减轻高脂饮食诱导的高血脂症并抑制肝脏内脂质堆积。
　　我们的研究集中在京尼平调控脂质代谢，特别是抑制肝脏内脂质堆积的分子机制方面。本研究以miRNA/SREBP-1c为主线，深入阐明京尼平调控脂质代谢的分子机制，为解决高血脂症和肝脏内脂质堆积提供新思路。

目录

声明

摘要

第1章绪论

1．1肥胖的发生

1．1．1肥胖的流行病学

1．1．2引起肥胖的原因

1．1．3肥胖的危害

1．2肥胖的治疗

1．2．1生活方式干预

1．2．2药物治疗

1．2．3手术治疗

1．2．4调节肠道菌群

1．3脂质代谢的分子机制

1．3．1脂质转运

1．3．2脂质合成

1．3．3脂质消耗

1．4京尼平

1．4．1京尼平的药代动力学

1．4．2京尼平对糖尿病的抑制作用

1．4．3京尼平的抗炎症作用

1．4．4京尼平对肝脏的保护作用

1．5 microRNAs

1．6本章小结

第2章京尼平改善高血脂症并降低肝脏脂质堆积

2．1引言

2．2材料与方法

2．2．1实验材料

2．2．2实验方法

2．3实验结果

2．3．1京尼平降低小鼠的体重

2．3．2京尼平对小鼠代谢活动的影响

2．3．3京尼平不影响小鼠血糖和胰岛素含量

2．3．4京尼平提高小鼠的胰岛素敏感性

2．3．5京尼平改善血脂水平

2．3．6京尼平改善小鼠肝功能

2．3．7京尼平降低小鼠肝脏内脂质含量

2．3．8京尼平改善小鼠肝脏内脂质堆积

2．4本章小结

第3章京尼平通过miR-142a-5p／SREBP-1c途径抑制肝脏脂质堆积

3．1引言

3．2材料与方法

3．2．1实验材料

3．2．2实验方法

3．3实验结果

3．3．1京尼平调控小鼠肝脏中脂质代谢相关基因的表达

3．3．2京尼平抑制小鼠肝脏中脂质合成基因的表达

3．3．3京尼平不影响小鼠脂肪组织中脂质合成基因的表达

3．3．4京尼平在原代肝细胞中的安全剂量

3．3．5京尼平降低原代肝细胞内脂质堆积

3．3．6京尼平抑制原代肝细胞内脂质合成基因的表达

3．3．7预测靶向Srebp-1c 3’UTR的microRNAs

3．3．8京尼平升高miR-142a-5p的表达

3．3．10 MiR-142a-5p抑制SREBP-1c的表达

3．3．11 MiR-142a-5p介导京尼平对SREBP-1c的抑制作用

3．3．12 MiR-142a-5p介导京尼平对脂质堆积的抑制作用

3．4本章小结

第4章结论与讨论

参考文献

附录

在读期间发表的论文

致谢