马链球菌兽疫亚种类M蛋白对细胞的粘附作用

摘要

马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)对集约化养猪业的发展危害严重，同时对养猪业的相关从业人员的健康具有潜在威胁。马链球菌兽疫亚种的类M蛋白是一种重要的表面蛋白和毒力因子，具有调理素功能，且能够抵抗抗体的吞噬细胞对其的吞噬作用。本试验在分子水平上对马链球菌兽疫亚种类M蛋白的粘附机制进行了研究，为该菌的致病机制及引起的猪链球菌病的防控进行了有益的探索。 根据已发表的马链球菌兽疫亚种猪源ATCC35246株的类M蛋白基因序列，设计和合成一对引物，并以ATCC35246株的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增出去掉信号肽的类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET-32a(+)中。重组质粒通过酶切鉴定和测序后，将重组质粒转化入大肠杆菌BL21进行原核表达，SDS-PAGE显示表达产物约60kD，Western blot显示，其与ATCC35246株多克隆抗血清反应，抗原性良好。 以His亲和层析拄纯化重组的类M蛋白作为抗原免疫6～8周龄的BALB／c小鼠，三次免疫后，取脾细胞并与对数期生长良好的SP2／0细胞进行融合，应用灭活的ATCC35246菌液为包被抗原，建立间接EIASA筛选阳性克隆，经过3次亚克隆之后得到12株稳定分泌抗类M蛋白单抗的细胞株，特异性检测显示其与猪链球菌2型等没有交叉反应。以BABL／c小鼠制备的腹水单抗，ELISA效价约为1:10000。 采用通用的模式细胞HEp-2细胞，研究马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白的粘附作用。结果显示，ATCC35246株可以粘附HEp-2细胞，它可以粘附细胞。用重组的类M蛋白预处理HEp-2细胞，当类M蛋白的量达到160μg／500μL，可以完全抑制细胞对细菌的粘附；用重组表达的类M蛋白鼠单抗血清处理ATCC35246，可抑制其对HEp-2细胞的粘附，在1:200倍稀释时即能完全抑制它对HEp-2细胞的粘附：而ATCC35246的全菌鼠抗血清在1:200时能完全抑制它对HEp-2细胞的粘附。同时，以12株单抗处理细菌以后，发现单抗2C8具有明显抑制细胞粘附的作用，说明2C8对应的抗原表位在细胞粘附中具有决定性作用。 以类M蛋白的单抗细胞株2C8分泌的单抗作为靶分子，研究其对应的抗原表位。用从前以试验得到的2C8单抗包被酶标条孔，从12肽随机肽库中经过5轮生物淘洗(结合、淘洗及富集)程序进行筛选，第2轮以后降低2C8的包被浓度，同时升高洗液中吐温-20的浓度。经5轮亲和筛选后，噬菌体的回收率从1.71×10<'-6>增加到3.39×10<'-4>假阳性率逐轮降低，由20.31％降至0.22％，表明阳性克隆得到了有效富集。从第5轮筛选出的阳性克隆中随机挑取14个进行扩增，然后对这些克隆采用ELISA和竞争ELISA来鉴定其结合性和特异性，发现10个克隆有较强的结合力而不与其它单克隆抗体反应。然后对这10个克隆进行测序。结果表明，所挑选的14个克隆均与单抗2C8有较强的结合性，其中10个克隆能够发生较强抑制作用；从所测10个克隆的氨基酸序列分析，“SLSR”为其核心表位，而在类M蛋白中没有对应的氨基酸序列，表明这段起决定作用的肽段构成的抗原表位为构象依赖型表位。上述研究结果可以推断出：在类M蛋白中，“SLSR”模拟的抗原构像表位在马链球菌兽疫亚种ATCC35246株粘附HEp-2细胞的过程中起到了决定性的作用，这对进一步研究马链球菌兽疫亚种的致病机制以及药物筛选、多肽疫苗的合理设计等有积极意义。

目录

文摘

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第一部分 文献综述 第一章 马链球菌兽疫亚种类M蛋白

第一部分 文献综述 第二章 噬菌体肽库展示技术的原理与应用

第二部分 试验研究 第三章 马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因的表达

第二部分 试验研究 第四章 马链球菌兽疫亚种类M蛋白单克隆抗体的制备

第二部分 试验研究 第五章 类M蛋白对HEp-2细胞的粘附作用

第二部分 试验研究 第六章 噬菌体肽库筛选类M蛋白有粘附活性的肽段

全文总结

致谢