猪卵母细胞的超低温冷冻保存及影响其冻后发育能力的机理研究

摘要

本研究共包括以下7个部分： 试验一、猪卵母细胞的采集与体外成熟研究本试验以屠宰场采集的猪卵巢卵母细胞为研究对象，旨在优化猪卵母细胞回收方法及其体外成熟培养体系，为进一步研究提供适用的猪GV期和MII期卵母细胞。以抽吸法采集猪卵巢中直径为2～5 IIllTI及直径大于5 mm卵泡卵母细胞，再用切割法采集直径小于2 mm卵泡卵母细胞。结果表明，切割法所获卵母细胞数及每只卵巢平均采卵数均显著高于抽吸法(分别为1300枚对570枚和31.O枚对13.6枚；P<0.05)；但切割法所获卵母细胞可用率仅为33.8％，显著低于抽吸法67.5％的可用率(P<0.05)。用抽吸法采集直径为2～5 mm的卵泡卵母细胞，分4组进行体外成熟培养，研究激素和猪卵泡液(pFF)对卵母细胞体外成熟的影响：I组(对照组)，成熟培养液为TCM-199(含10％NCS)+pFF+PMSG+hCG+17β-E2+L-半胱氨酸，卵母细胞在其中培养44 h；Ⅱ组(无激素组)，成熟培养液为TCM-199(10％NCS)+pFF+L一半胱氨酸，卵母细胞在其中培养44 h；Ⅲ组(无卵泡液组)，成熟培养液为TCM-199(10％NCS)+PMSG+hCG+17β-E2+L-半胱氨酸。卵母细胞在其中培养44 h；Ⅳ组(基础培养液组)，卵母细胞在成熟培养液(同I组)中培养24 h后，转入基础培养液TCMl99(10％NCS)+L-半胱氨酸组中，继续培养20 h。结果表明，卵母细胞在添加激素和pFF的成熟培养液中培养24 h后，转入无激素、无pFF的基础培养液中继续培养20 h，体外成熟率达78.8％，明显高于另外3组(P＜0.05)。 试验二、猪GV期与MII期卵母细胞的超微结构特征 本试验以猪GV期和MII卵母细胞为研究对象，观察猪新鲜卵母细胞在体外成熟前后的超微结构特征，为研究冷冻后卵母细胞超微结构的变化提供参考和对照。扫描电镜与透射电镜观察结果表明，在猪GV期卵母细胞，其卵丘细胞紧密包绕在卵母细胞外围，卵丘细胞的突起伸入透明带内，透明带呈不规则的蜂窝状；微绒毛相对较长、数量较多，并插入透明带内；卵母细胞充满于透明带内，看不到明显的卵周隙；胞质内高尔基复合体发达，线粒体成簇分布于脂滴附近；脂滴表现为均质和不均质两种形式，大多以均质脂滴存在，脂滴周围存在有不连续的滑面内质网。在猪MII期卵母细胞，其卵丘细胞结构松散、扩展；微绒毛数量减少，变短、变粗，并从透明带内撤回；透明带上的蜂窝状小孔增多，小梁突起更为明显，卵周隙明显；线粒体仍成簇伴随脂滴分布，脂滴以不均质结构为主，其絮状物结构更为明显，脂滴外仍有不连续的滑面内质网；皮质颗粒呈单层排列于质膜下。 试验三、猪GV期与MII期卵母细胞微丝、微管与染色体分布的特点与规律 本试验采用免疫荧光技术，在激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)下观察、分析猪卵母细胞体外成熟培养前后的细胞骨架结构，为研究冻后卵母细胞细胞骨架的变化提供对照。结果表明，新鲜GV期与MII期卵母细胞，其微丝、微管和染色体结构和分布具有不同的特点和规律。在GV期卵母细胞，结构完整的微管尚未形成，染色体也未致密化并存在于生发泡内，而微丝则分布于质膜下及整个胞质中。MII期卵母细胞的微管，主要存在于纺锤体上，少量微管出现在第一极体(pbI)周围，染色体排列于纺锤体赤道板上，微丝均匀分布于质膜下。正是微丝、微管和染色体的相互作用，调节着卵母细胞成熟与发育的进程。试验四、冷冻保护剂处理对猪卵母细胞发育能力的影响 本试验以猪GV期和MII期卵母细胞为研究对象，选用报道较多的三种冷冻保护剂组合(EDS、EFS和ES)，仅对卵母细胞作冷冻前后的程序处理，而不进行冷冻，研究室温条件下所用冷冻保护剂的毒性作用及其对卵母细胞发育能力的影响。其中，EDS组合由乙二醇(EG)、二甲亚砜(DMSO)和蔗糖(Sucrose)组成；EFS组合由EG、Ficoll-70和Sucros组成；而ES则由EG和Sucrose组成。结果表明，GV期卵母细胞经处理后，各试验组FDA染色存活率与对照组均无显著差异(分别为92.4％，93.4％和92.4％对95.5％，P＞O.05)，各试验组间卵母细胞体外成熟率和体外受精率虽无显著差异，但均低于对照组。其中，EFS组和ES组处理后卵母细胞体外成熟率(68.8％和74.8％)和体外受精率(42.9％ 和51.7％)与对照组(分别为76.7％和55.4％)均无统计学差异，表明该两组对卵母细胞的毒性作用相对较小。MⅡ期卵母细胞各组FDA染色存活率也无明显差异(P>0.05)，各试验组间体外受精后的卵裂率差异不显著，但都低于对照组(53.1％)。其中，ES处理组卵裂率(45.9％)与对照组无统计学差异(P>0.05)，EDS和EFS处理组受精后卵裂率(分别为41.0％和40.7％)显著低于对照组(P<0.05)。总之，无论GV期还是MⅡ期卵母细胞，ES组处理对卵母细胞存活率与发育能力影响最小。试验五、玻璃化冷冻对猪卵母细胞发育能力的影响 为了评价猪GV期和MⅡ期卵母细胞经OPS法玻璃化冷冻后的发育能力，本研究首先对卵母进行细胞松弛素B及细胞松弛素B和离心极化共处理，研究卵母细胞发育能力；在此基础上，对猪卵母细胞进行直接冷冻，或冷冻前进行细胞松弛素B处理或细胞松弛素B和离心极化共处理；并对卵母细胞冷冻后，其透明带在链霉蛋白酶中的消化时间进行了比较。结果表明，猪GV期卵母细胞经细胞松弛素B处理后，体外成熟率(79.4％)与对照组(76.0％)无显著差异，但体外受精后的卵裂率显著低于对照组(40.7％对55.0 ％，P<0.05)。而GV期和MⅡ期卵母细胞经细胞松弛素B和离心极化处理后，发育能力均显著低于对照组，P<0.05；直接进行OPS法玻璃化冷冻，及卵母细胞经细胞松弛素B处理或经细胞松弛素B加离心共处理后再行冷冻，冻后GV期和MⅡ期卵母细胞均获得了较高的形态正常率；但冻后FDA染色存活率均显著低于对照组(P<0.05)，GV期分别为56.8％、45.7％和49.0％对95.4％，MⅡ期分别为41.9％、44.3％和49.3％对95.5％。冻后各组间GV期卵母细胞的体外成熟率均存在显著差异(分别为42.6％、30.4％和27.0％)，并显著低于对照组卵母细胞体外成熟率(73.9％，P<0.05)。冻后GV卵母细胞，仅直接冷冻组获得7.8％的体外受精卵裂胚，显著低于对照组53.3％的卵裂率(P<0.05)，但在培养结束时，12枚来自冷冻卵母细胞的卵裂胚中，有6枚发育至8-细胞，3枚发育至16-细胞，3枚发育至桑椹胚；MⅡ期卵母细胞各试验组解冻后均未获得体外受精卵裂胚；卵母细胞透明带消化试验表明，与新鲜GV期卵母细胞相比，体外成熟卵母细胞透明带消化时间显著增加(分别为1.4 min和3.0 min，P<0.05)。冻后GV期卵母细胞透明带消化时间(1.8 min)显著高于新鲜GV期卵母细胞透明带消化时间，而冻后MⅡ期卵母细胞透明带消化时间则显著低于新鲜MⅡ期卵母细胞(分别为2.5 min和3.0 min，P<0.05)。 本研究提示，细胞松弛素B和离心极化处理并未改善卵母细胞冷冻效果，冻后卵母细胞的透明带蛋白质特性似乎发生了改变。 试验六、猪卵母细胞玻璃化冷冻后超微结构的变化 本试验旨在研究猪未成熟(GV期)和体外成熟(MII期)卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化。冷冻-解冻后的GV期和MII期卵母细胞，随机挑选胞质均匀、形态正常的卵母细胞制备电镜样本。透射电镜观察结果表明，猪GV期卵母细胞经玻璃化冷冻后，主要表现为部分卵丘卵母细胞复合体(COC)的卵丘细胞发生碎裂、脱落，透明带破损；卵丘细胞与卵母细胞间的连接受到破坏，卵母细胞微绒毛断裂、消失、数量减少，部分线粒体发生肿胀、基质减少、嵴模糊；卵母细胞内脂滴多呈均质状。而MII期卵母细胞冷冻后，透明带也发生破损，卵丘细胞与卵母细胞间交流中断，微绒毛断裂、脱落，但皮质颗粒仍呈单层排列于质膜下；仅可见形态不规则的不均质脂滴，其周围严重空泡化。总的看来，卵母细胞冻后的脂滴变化最为明显：GV期卵母细胞冷冻后仅可见均质脂滴，而MII期卵母细胞冻后仅见不均质脂滴，且脂滴空泡化十分明显。冻后卵母细胞的脂滴变化可能是影响卵母细胞发育能力的重要原因之一，但这种变化影响冻后卵母细胞发育的确切机制仍有待进一步研究。试验七、猪卵母细胞玻璃化冷冻后细胞骨架结构的变化为了澄清卵母细胞玻璃化冷冻后，对细胞骨架造成的影响，本试验对猪GV期和MII期卵母细胞经玻璃化冷冻后，微丝、微管及染色体的变化情况进行了比较。本研究结果提示，猪GV期和MII期卵母细胞经冷冻保护剂处理或玻璃化冷冻保存后，都明显造成了纺锤体、染色体和微丝不可逆的损伤，该损伤可能是影响卵母细胞成熟、受精与发育的重要原因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号及缩略语

前言

第一部分文献综述 第一章卵母细胞的体外成熟与体外受精

第一部分文献综述 第二章卵母细胞的超微结构与细胞骨架

第一部分文献综述 第三章哺乳动物卵母细胞的冷冻保存

第二部分试验研究 第四章猪卵母细胞采集与体外成熟研究

第二部分试验研究 第五章猪GV期和MII期卵细胞的超微结构特征

第二部分试验研究 第六章猪GV期和MII期卵母细胞微丝、微管与染色体分布的特点与规律

第二部分试验研究 第七章冷冻保护剂处理对猪卵母细胞发育能力的影响

第二部分试验研究 第八章玻璃化冷冻对猪卵母细胞发育能力的影响

第二部分试验研究 第九章猪卵母细胞玻璃化冷冻后超微结构的变化

第二部分试验研究 第十章猪卵母细胞玻璃化冷冻后细胞骨架的变化

全文结论

图版及说明

致谢

附录：博士期间论文发表情况