枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Bs-916胞外抗菌蛋白质的纯化及其鉴定

摘要

枯草芽孢杆菌Bs-916是我们自行分离的一株拮抗菌，目前用于防治水稻纹枯病和稻曲病，该菌株表现出广谱的抑菌活性。本文研究了枯草芽孢杆菌Bs-916及分泌液对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、蚕豆枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schlecht. f. fabae Yu et Fang)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme Sheld.)、西瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum(Schl.)f.sp.nieveum(E.F.Smith)Snyderet Hansen)、水稻稻瘟病菌 (Pyricularia grisea)、水稻稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)、水稻白叶枯病菌 (Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Ishiyama)Zoo)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola Dowson)的抑菌活性，发现枯草芽孢杆菌Bs-916及其分泌物对上述病原菌均具有较强的抑菌活性，具有广谱性的特点。同时，采用丙酮沉淀、PEG沉淀、等电点沉淀和超微浓缩，发现沉淀物和截留物都有抑菌活性，提示枯草芽孢杆菌胞外存在蛋白质类抗菌物质。 用硫酸铵分级沉淀枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质，共获得8个蛋白质粗提物，其中硫酸铵饱和度为40％～50％和50％～60％提取的粗蛋白质具有较强的抑菌活性，说明该抗菌蛋白质在硫酸铵饱和度为40-60％时就可完全沉淀。研究结果表明：硫酸铵饱和度40％～50％和50％～60％提取的粗蛋白质浓度分别为17.261μg/l和18.899μg/ml，上述两者粗提物对水稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌有较强的抑菌活性，对马铃薯晚疫病菌没有抑菌活性：当温度高于40℃时抑菌活性均降低，但在120℃时仍有部分抑菌活性；对pH值适应范围较宽，在pH值为13.6时抑菌活性均丧失；经蛋白酶K、蛋白酶E、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后，抑菌活性均下降。SDS-PAGE电泳结果表明枯草芽孢杆菌Bs-916能分泌多种蛋白质。 采用了层析技术分离和纯化了枯草芽孢杆菌Bs-916胞外的抗菌蛋白质。利用 DEAE Sepharose Fast Flow柱层析，后获得3个蛋白质吸收峰，其中B峰具有抑菌活性，将B峰收集液过疏水层析柱Phenyl Sepharose 6 FF后获得2个吸收峰，其中第E峰具有抑菌活性，再将第E峰收集液过羟基磷石灰石柱层析后得到了2个蛋白质吸收峰，其中第G峰具有抑菌活性，经SDS-PAGE检测后为单一的蛋白质条带(暂定名： Bacisubin)，该蛋白质的分子量约为41.9kDa。研究了胞外抗菌蛋白质(bacisubin)的抑菌活性。发现抗菌蛋白质(Bacisubin)对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisease)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、甘蓝黑斑病菌(Alternaria oleraea)、白菜黑斑病菌病菌(A.brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒炭疽病菌(C.capsici)和水稻恶苗病菌(F. moniliforme)均有抑菌活性。尤其对Alternaria属的病原菌具有较高的毒力。结果显示抗菌蛋白质Bacisubin具有广谱、高毒力的特点。抗菌蛋白质(Bacisubin)对水稻纹枯病菌、灰霉病菌、甘蓝黑斑病菌和白菜黑斑病菌的EC<,50>分别为4.011μM、2.740μM、0.087μM和0.055μM。枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质(Bacisubin)的抑菌机制是造成病原菌菌丝营养吸收困难，致使菌丝顶端膨大，分支增加，胞壁加厚、断裂，从而抑制了病原菌的生长。同时该抗菌蛋白质具有凝集素活性和核糖核酸酶活性。枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质(Bacisubin)无蛋白酶活性和蛋白酶抑制活性。 利用生物质谱技术鉴定了枯草芽孢杆菌胞外抗菌蛋白质。胞外抗菌蛋白质(Bacisubin)经过胰蛋白酶消解后，经基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得22个质荷比峰(M/Z)，Matrix Science数据库检索未发现显著相关的蛋白质。再经电喷雾四极杆飞行时间串联质谱分析后(Q-TOF2)后获得五个肽的氨基酸序列，氨基酸序列分别为VTIVDEKGR，FSDSDVMNR. VYIADSTNFK，ELPISENLASVNMR，EAEWAYMITGK。经鉴定，该蛋白质和一种枯草芽孢杆菌的草酸盐脱羧酶和地衣芽孢杆菌的草酸盐脱羧酶具有显著的相关性，关于草酸盐脱羧酶的抑菌活性和其他生物活性未见报道。

目录

文摘

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上篇：文献综述

第一章：枯草芽孢杆菌防治植物病害研究进展

1、植物病害的发生及防治现状

2、枯草芽孢杆菌防治植物病害的现状

3、枯草芽孢杆菌防治植物病害的机制

4枯草芽孢杆菌在植株上的定殖研究

5、枯草芽孢杆菌的来源

6、以枯草芽孢杆菌为核心的知识产权情况

7、枯草芽孢杆菌防治植物病害的展望

参考文献

第二章枯草芽孢杆菌的抗菌物质

1、枯草芽孢杆菌非核糖体途径合成的抗菌物质——小分子抗菌素

2枯草芽孢杆菌核糖体途径合成的抗菌物质——抗菌蛋白质(肽)

3枯草芽孢杆菌胞产生的具有抗菌活性的蛋白酶

4、枯草芽孢杆菌的抗菌物质研究展望

参考文献

第三章抗菌蛋白质的研究进展

1、抗菌的作用靶点

2、抗菌蛋白质的分类及其作用机制

3、抗菌蛋白质的研究展望

参考文献

第四章蛋白质的分离、纯化及鉴定

1、蛋白质的粗分离

2、蛋白质的精细分离

3、蛋白质的鉴定

4、蛋白质的分离、鉴定技术对抗菌蛋白质研究的影响

参考文献

下篇：研究内容

第一章：枯草芽孢杆菌Bs-916的抑菌活性及其抑菌物质分析

摘要

1、材料和方法

2、结果与分析

3、讨论

参考文献

第二章：枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌粗蛋白质的性质

摘要

1材料与方法

2、结果

3、讨论

参考文献

第三章：枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的分离和纯化

摘要

一、材料和方法

2结果与分析

三、讨论

参考文献

第四章：枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的生物学功能分析

摘要

1、材料和方法

2、结果与分析

3、讨论

参考文献

第五章：枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的鉴定

摘要

1、材料和方法

2、结果与分析

三、讨论

参考文献

全文结论

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致谢