云南羊肚菌分类及其生长土壤微生物群落结构分析

摘要

羊肚菌的人工栽培至今未能成功，半人工栽培中不仅要求覆土，而且要求覆土中含有刺激其结实机制的有益微生物，因此找出有助于结实的关键微生物种类，模仿其野生环境，这或许是羊肚菌栽培取得成功的较方便的途径。 本论文从羊肚菌的生长环境着手，主要考虑羊肚菌生长土壤中的微生物区系，采用变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术以土壤微生物群体的基因组DNA为研究对象，通过比较不同土壤中各种微生物的rDNA基因信息了解其多样性。通过对比羊肚菌生长土壤及对照不长羊肚菌土壤中微生物群落结构，找出羊肚菌生长土壤中特殊种群；通过对比不同地区羊肚菌生长土壤找出不同地方羊肚菌的微生物群落结构的异同；从而为今后实现羊肚菌的人工栽培提供一些参考依据，所做工作主要分为以下几部分。 (1)依据子实体形态差异，挑选了14个羊肚菌子实体(其中11个来自云南，3个来自浙江)，利用通用引物对(ITS<,1>、ITS<,4>)扩增rDNA的ITS区，PCR产物经纯化回收、克隆、测序，然后在GenBank中进行序列比对，找相似性较高的种属，以确定云南的羊肚菌种以及各种之间序列的差异。结果表明，云南的11个羊肚菌子实体可分为4个种：高羊肚菌(Morchella elata)、尖项羊肚菌(Morchella conica)、粗柄羊肚菌(Morchella crassipes)和大孔(宽肋)羊肚菌(Morchella costata)，其中大孔(宽肋)羊肚菌在云南是首次发现。浙江的3个羊肚菌子实体经鉴定为未知羊肚菌种。采集的14个羊肚菌子实体样品和GenBank中黑脉(小顶)羊肚菌[Morchella angusticep (AJ698476)]、美味羊肚菌[Morchella esculenta (AJ698475)]，以及羊肚菌科常见属钟菌属Verpa conica(AJ544206)的ITS序列聚类，以钟菌(AJ544206)作为外类群，可分为三大聚类群，高羊肚菌、大孔(宽肋)羊肚菌、黑脉(小顶)羊肚菌为第1类群(Groupl)；美味羊肚菌、尖顶羊肚菌为第2类群(Group2)；粗柄羊肚菌和M<,12>、M<,13>、M<,14>为第3类群(Group3)。发现一种ITS 5.8s与其他存在巨大变异的羊肚菌，有可能为新的种。 (2)半人工栽培要求覆土，可能覆土中含有刺激其结实机制的有益微生物或相关代谢物质，羊肚菌子实体内生菌，势必与羊肚菌的生长存在密切关系，本实验采用DGGE电泳技术，避开传统的纯培养不能全面反映内生菌种群的弊端，先从子实体中含有的细菌着手，旨在通过其对其种类的鉴定，找出与羊肚菌生长关系密切的细菌种群。结果表明，共测序得到7种内生细菌，PCR-DGGE方法可以在一定程度上反应微生物群落结构。 (3) 通过PCR-DGGE的方法，实验结果显示：①所取4种土样样品中所测序的15种细菌主要归属于拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门和变形菌门，其中以拟杆菌门的细菌最多，有5-7种，放线菌门的有2-3种，厚壁菌门2种，变形菌门2种，绿弯菌门1种。羊肚菌生长土壤与相对应的附近菜园土相比，在优势种群上并无很大区别，4种土样的优势种群基本相同。②羊肚菌生长土壤中，测序得到的12种真菌中，子囊菌亚门盘菌纲的有10种，2种担子菌亚门异形担子菌纲，有盘菌纲，异形担子菌纲。结合对照中测序得到的盘菌纲真菌种类，盘菌纲真菌群落存在很大的差异。 本文了解到了羊肚菌生长土壤中存在的细菌和真菌种类，并得到了羊肚菌生长土壤中盘菌纲的真菌种类比较多的结论，对于羊肚菌的生长和盘菌纲的真菌是否真有关系，目前还不能确定，今后的工作者，可结合有科研工作者在进行羊肚菌覆土栽培试验中经常长出盘菌的现象，进行进一步的研究。

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文摘

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声明

第一章文献综述

1.羊肚菌概述

1.1羊肚菌的种类和分布

1.2营养成分与价值

1.3生活史与栽培现状

2.微生物生态学研究进展

2.1基于PCR的研究方法

2.2生物标志物(Biomarker)法

2.3核酸杂交技术

2.4变性梯度凝胶电泳DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

2.5其它研究微生物群落结构的方法

2.6分子生态学在土壤微生物研究中的应用

3研究的目的、意义

第二章实验材料与方法

1供试材料

2实验仪器与试剂

3实验方法

3.1云南羊肚菌核糖体DNA的ITS序列与亲缘关系分析

3.2羊肚菌内生细菌基因组DNA的PCR-DGGE鉴定

3.3云南丽江地区羊肚菌生长土壤细菌多样性分析

第三章结果与分析

1土壤中微生物总DNA的提取

2云南羊肚菌rDNA的ITS序列与亲缘关系分析

3羊肚菌内生菌基因组DNA的PCR-DGGE鉴定

4 DGGE对土壤样品细菌群落结构的分析

5 DGGE对土壤样品真菌群落结构的分析

第四章讨论

1培养料中微生物总DNA的提取

2云南羊肚菌rDNA的ITS序列与亲缘关系分析

3有关群落结构分析上的一些问题

4微生物群落结构的研究

5总结性讨论

参考文献

附录

致谢