翅鳞伞(Pholiota squarrosa)AS5.245胞内蛋白PSPB-2的分离纯化及其生物学活性的研究

摘要

肿瘤目前仍是临床难以治疗的疾病之一，对人类的健康有很大危害，现在临床治疗肿瘤的主要方法是手术、化疗、放疗，给病人带来生存希望的同时也给病人带来较大创伤。化疗、放疗副作用较大，使病人恢复的较慢，多年来众多学者一直在寻找有效治疗恶性肿瘤的药物，尤其是筛选高效、低毒、低成本的天然药物，倍受生物学和医学界的关注。 本文研究的主要对象一翅鳞伞[Pholiota squarrosa(Per. ex Fr.)]AS5.245，属于担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycete)，伞菌目(Agaricales)，球盖菇科(SNophariaceae)，鳞伞属[Pholiota(Fr.) kumm.]。目前国内外关于翅鳞伞AS5.245研究的报道几乎还是空白，本文在前期实验的基础上，以翅鳞伞为材料，利用各种层析技术对其活性物质进行了分离纯化，并对其活性进行了研究。 1：本研究参考稻瘟霉模型活性追踪方法，筛选出水稻纹枯菌为指示菌的活性追踪方法。通过水稻纹枯菌活性追踪及MTT方法，发现抑制菌丝体生长和抑制癌细胞增殖之间存在一定关系，可以利用抑制水稻纹枯菌丝体生长的方法，对翅鳞伞中抑制肺癌细胞增殖的活性物质做初步筛选。 2：应用硫酸铵沉淀、活性炭吸附和离子交换层析等现代层析分离技术，得到了电泳纯的蛋白，并进一步对翅鳞伞蛋白抑制水稻纹枯病菌丝体生长和其抑制癌细胞增殖活性进行研究，结果表明翅鳞伞蛋白可以显著抑制肺癌细胞A549的增殖。翅鳞伞菌丝体蛋白可明显抑制体外培养的肺癌细胞( A549)的增殖。翅鳞伞菌丝体蛋白含量达到20μg/mL时，对肺癌细胞(A549)的抑制率可达65％以上。 3：利用jc-1检测试剂盒来检测线粒体跨膜电位，实验表明活性蛋白可使肺癌细胞线粒体跨膜电位的下降，再利用TUNEL检测试剂盒可检测到，一部分肺癌细胞经诱导产生3'OH末端，被荧光素标记。 4：通过研究发现蛋白具有对质粒PUC18单一的内切酶酶切位点。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩写符号

声明

第一章文献综述

1食药用真菌的研究进展

2核糖体失活蛋白

2.1蓖麻蛋白(Ricin)

2.2天花粉蛋白(TCS)

2.3核糖体失活蛋白的作用机理

3在蕈菌中发现的具有抗肿瘤活性的蛋白

4肿瘤细胞凋亡的研究进展

5细胞坏死

5.1引起细胞坏死的原因

5.2细胞坏死机制

5.3坏死的调控对于治疗的意义

6常用的检测细胞方法细胞

6.1荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜检测法

6.2线粒体膜势能的检测

6.3 TUNEL法

7抗肿瘤细胞增殖筛选的方法

7.1分子水平筛选模型

7.2细胞水平筛选模型

7.3疾病动物模型、转基因和基因敲除动物模型

8本研究的目的

参考文献

第二章翅鳞伞AS5.245蛋白的生物学活性研究

1材料和方法

1.1材料和试剂

1.2试剂配制和培养基

2实验方法

2.1翅鳞伞发酵培养

2.2翅鳞伞[Pholiota squarrosa]胞外蛋白液制备

2.3翅鳞伞[Pholiota squarrosa]发酵菌丝体提取液的制备

2.4硫酸铵沉淀法翅鳞伞发酵产物中的蛋白

2.5透析

2.6活性液浓缩

2.7翅鳞伞胞内、胞外蛋白对真菌毒力测定

2.8细胞复苏

2.9细胞传代

2.10翅鳞伞蛋白抑制人肺癌细胞株(A549)增殖的体外实验

2.11翅鳞伞蛋白作用人肺癌细胞株(A549)的形态学观察

3结果与讨论

3.1翅鳞伞蛋白对不同菌株的毒力测定

3.2翅鳞伞蛋白抑制人肺癌细胞株(A549)体外抑制增殖实验

3.3翅鳞伞蛋白作用人肺癌细胞株(A549)形态学观察

4本章小结

参考文献

第三章翅鳞伞胞内抗肿瘤蛋白的分离纯化

1材料和方法

1.1主要实验材料

1.2方法

2结果与讨论

2.1活性炭吸附预处理蛋白

2.2 DEAE-Sephacel柱层析

2.3 Sephadex G-100柱层析

2.4蛋白质电泳

2.5蛋白分子量测定

2.6硫酸-蒽酮法鉴定蛋白

2.7 PSPB-2蛋白抗真菌活性及其对肺癌细胞作用的形态学观察

3本章小结:

参考文献

第四章PSPB-2抑制肺癌细胞(A549)的作用机理及其生物学活性的探讨

1材料和方法

1.1材料

1.2试剂

1.3常用溶液

1.4仪器

2.方法

2.1 A549细胞培养

2.2抑制A549细胞增殖的体外实验

2.3 A549细胞的形态学观察

2.4细胞的线粒体膜电位的检测

2.5 TUNEL法检测凋亡

2.6 PSPB-2的核酸内切酶作用的研究

3结果与讨论

3.1 PSPB-2抑制A549细胞增殖的体外实验

3.2激光共聚焦扫描显微镜对A549细胞的形态学观察

3.3细胞的线粒体膜电位的检测

3.4 TUNEL法检测凋亡

3.5核酸内切酶作用

4本章小结

参考文献

全文结论

全文创新点

致谢

攻读硕士期间发表论文