犬支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及fimN基因的克隆、表达和表达蛋白免疫原性分析

摘要

犬窝咳是由犬支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)犬腺病毒(CAV)、犬瘟热(CDV)和犬副流感病毒(CPiV)中的一种或几种病原混合感染引起的。本实验主要目的是了解犬支气管败血波氏杆菌在窝咳犬中的分布，分析比较Bb分离株的生物学特性，并同时比较三种病毒在窝咳犬中的检出。从南京地区和北京地区采集了164份患有窝咳的犬鼻腔拭子进行Bb的分离鉴定，经培养性状、形态学检查、生理生化试验、血清学鉴定及PCR鉴定，最终分离到16株Bb，分离率为9.8％，药敏试验结果显示16株细菌生物学特性和对抗生素敏感性基本相同。对16份Bb阳性病料样品进行犬腺病毒、犬瘟热、犬副流感病毒检测，结果表明窝咳犬由Bb引发的凡率占10％，和三种病毒混合感染的情况者占81％。 对2006年11月至2008年1月在北京和南京地区分离的16株犬波氏杆菌和一株兔波氏杆菌参考株的fimN基因进行了全长克隆，用MegAlign(DNAStar)比较分析分离株与GenBank中收录的犬波氏杆菌参考株(登录号AF231910)的fimN核苷酸序列，绘制基因进化树。结果表明，16株支气管败血波氏杆菌的fimN基因序列同源性与犬波氏杆菌参考株序列的同源性在99％以上，和兔波氏杆菌参考株的序列同源性也在99％以上，表明南京和北京两地的犬源支气管败血波氏杆菌的fimN核苷酸序列基本无变化。 对克隆载体pMD18T-fimN进行双酶切，将得到的630bp片段以正确的阅读框架定向克隆于pET-32a(+)中，构建PETBb-fimN重组质粒表达载体，然后将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在37℃1mM IPTG诱导下该片段获得良好的表达。经SDS-PAGE鉴定其表达的融合蛋白质约39.4kDa，与预期值一致，免疫转印试验显示，体外表达的该重组蛋白可被兔支气管败血波氏杆菌NK0610株兔抗血清识别。表达蛋白纯化后免疫实验兔，通过琼脂扩散试验测血清抗体效价，结果显示血清的沉淀效价为1:40，表明该重组蛋白具备天然菌毛蛋白N基因的部分抗原表位，为研制CDV的亚单位疫苗提供了侯选材料。

目录

文摘

英文文摘

声明

A篇 文献综述

第一章 支气管败血波氏杆菌研究进展

1形态及培养特性

2抗原

3 毒素

4其他生物学特性

5流行病学

6临床症状及病理变化

7诊断和治疗

8支气管败血波氏杆菌对人类健康的影响

参考文献

B篇 实验研究

第二章 犬支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定

1材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 16株犬波氏杆菌分离株fimN基因序列分析

1材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 犬支气管败血波氏杆菌(Bb)fimN基因的表达和表达蛋白免疫原性分析

1材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文总结

致谢