猪肌内脂肪沉积相关调控基因的分离与鉴定

摘要

目前，从分子水平上进行猪的品种选育已经成为可能，但是对对肌内脂肪沉积的分子调节机制仍缺乏系统的了解.本研究通过差异显示逆转录聚合酶链式反应( DDRT-PCR)的方法鉴定在肌内脂肪含量差异极显著的个体间背最长肌差异表达的基因，其目的在于寻找参与肌内脂肪沉积调控的相关基因，并为猪的肌内脂肪性状选育提供理论依据和技术支持。 实验一：从90头180日龄苏太猪中(平均肌内脂肪含量2.72±0.13％)分别选取肌内脂肪含量最高和最低各6个个体组成两组，其平均肌内脂肪含量分别为5.79％±0.35％和0.98％±0.09‰组间差异极显著(p<0.01).采用3条锚定引物，12条随机引物组成36种引物组合进行DDRT-PCR，共获得14条差异表达条带，通过NCBI比对发现其中4条序列与已知基因高度同源.分别命名为clonel(691bp)，clone2(160bp)，clone3(350 bp)，clone4(550 bp).clonel与肌内脂肪含量存在正相关，并与人剪切因子丝氨酸-精氨酸富集蛋白SRrp130高度同源，同源性为99％，clone2.clone3，clone4与肌内脂肪含量负相关，并分别与猪主要组织相容性抗原I基因(SLA-1)，人细胞核受体共激活因子1基因(SRC-1)，猪肌动蛋白重链2b基因(MYH2b)一致或高度同源，同源性分别为100％，94％，100％.对clonel进行电子延伸并进行部分测序，获得猪SRrp130基因完整开放阅读框3227bp序列，编码805个氨基酸。 最后从90个个体中选取肌内脂肪最高和最低的各15个个体组成两组，肌内脂肪平均含量分另q为4.46％±0.29％和166％±0.16％(p<0.05)，通过RT-PCR和real timePCR定性和定量检测各基因表达水平，定量结果显示SRrp130，SRC-1基因表达模式与差显结果相似.SRrp130 mRNA表达水平与肌内脂肪含量呈正相关关系(r=0.54P<0.01)，SRC-1表达水平与肌内脂肪含量呈负相关(r=-0.38，P<0.05)。 实验二：第一部分实验鉴定出的SRC-1/NCOA1基因与肌内脂肪含量之间存在密切关系，该基因为细胞核受体共激活因子p160家族的一个成员，该家族包括3个成员，它们分别为NCOA1，NCOA2和NCOA3基因，，最近通过对小鼠中这三个成员的敲除发现它们在能量代谢中发挥重要作用.这部分研究首先克隆了NCOA2和NCOA3的完整开放阅读框，在此基础上研究它们的表达水平与肌内脂肪含量的关系。 实验选取180日龄的长白猪和大约克猪杂交F1代个体.通过比较基因组学的方法，采用人的NCOA2和NCOA3基因调取猪的EST序列，以此为模板设计引物进行PCR扩增并测序，获得了它们完整的开放阅读框，分别为7，628 bp的NCOA2基因(EU346672)以及5，005 bp的NCOA3基因(EU346674).同时在分析的过程中，发现了NCOA2的第二种剪切体，获得了含完整开放阅读框的7421bp的NCOA2基因选择性剪切体2(EU346673)。 虽然猪的NCOA1基因已经公布(DQ078269)，但是NCOA1 mRNA在人上目前已经发现了含有不同开放阅读框的3种选择性剪切体，在小鼠中也只有一种剪切体。为了验证猪背最长肌中是否表达其他的剪切体，本实验通过电子延伸和部分测序对NCOA1.mRNA进行了研究，结果鉴定出含有不同开放阅读框的两种新剪切体(EU346670，EU346671)，长度分别为6534bp和6591bp。 对这个家族的所有3个成员以及它们的剪切体进行氨基酸序列比对，首次发现NCOA2选择性剪切体2比其他成员少一个核心功能基序LXXLL，这一功能区主要参与了共激活因子对细胞核受体的选择以及对细胞核受体的特异性， 从所有的60头F1代个体中选取肌内脂肪最高和最低的各15头个体组成肌内脂肪含量差异显著的两组，肌内脂肪平均含量分别为3.12％±0.19％和1.21％±0.15％(P<0.05)，采用real time PCR检测p160家族成员及剪切体的表达水平.定量结果显示NCOA1总表达量(r=-0.516，p<0.01)及选择性剪切体2(r=-0.554，p<0.01)与肌内脂肪沉积量负相关，而NCOA2选择性剪切体1(r=0.605，p<0.01)和NCOA3(r=0.435，p<0.05)与肌内脂肪含量呈正相关，组间表达差异显著(P<0.05)。 通过基因组比较，确定NCOA2基因位于猪4号染色体的65cM处，处于已报道肌内脂肪QTL峰值区域，另外在牛中该基因位于14号染色体上大理石纹QTL区域。该基因有望成为新的肌内脂肪含量候选基因。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章文献综述

1猪肌内脂肪研究概况

1.1脂肪细胞发育

1.2肌内脂肪

1.3猪肌内脂肪沉积的分子调控机制

1.4本研究的目的意义

参考文献

第二章不同肌内脂肪含量苏太猪个体背最长肌的基因差异表达研究

引言

1.实验材料

1.1试验动物

1.2网络资源及软件

1.3试剂

1.4仪器设备

2实验方法

2.1背最长肌肌内脂肪含量的测定

2.2背最长肌组织RNA提取

2.3甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量

2.4 RNA池的制备

2.5 DNase Ⅰ处理

2.6 cDNA的合成

2.7 DDRT-PCR反应

2.8 12％聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳

2.9银染法显色

2.10差异片段的切取

2.11差异片段的再扩增

2.12 PCR产物克隆

2.13电子延伸及部分测序

2.14 RT-PCR定性鉴定阳性克隆

2.15 real-time PCR定量分析

3.结果

3.1 RNA纯度与浓度

3.2 cDNA鉴定结果

3.3 mRNA差异显示结果

3.4差异片段的回收与再次扩增

3.5差异片段的克隆及PCR鉴定

3.6差异片段的序列分析

3.7电子延伸及部分测序

3.8 RT-PCR定性鉴定

3.9 real-time PCR定量分析结果

4.讨论

4.1 SRC-1 mRNA表达水平与肌内脂肪含量负相关

4.2 SRrp130 mRNA表达水平与肌内脂肪含量正相关

参考文献

第三章猪共激活子p160家族全长cDNA的克隆，表达及其对背最长肌肌内脂肪沉积的影响

引言

1实验材料

1.1试验动物

1.2网络资源及软件

1.3试剂

1.4仪器设备

2实验方法

2.1背最长肌肌内脂肪含量的测定及背最长肌组织RNA提取

2.2第一链cDNA的合成

2.3猪NCOA1，NCOA2,NCOA3克隆

2.4 PCR扩增及凝胶电泳

2.5 real-timo PCR相关性分析

3结果

3.1猪p160家族成员测序及选择性剪切体鉴定

3.2猪p160家族成员氨基酸序列比对及其特征

3.3猪p160家族成员在背最长肌中的表达以及它们对肌内脂肪含量的影响

4.讨论

4.1猪p160家族成员在进化上高度保守

4.2 p160家族成员与肌内脂肪代谢

4.3 NCOA2是肌内脂肪QTL区域内的候选基因

参考文献

论文总体结论

致谢

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