与耐贮性相关的水稻脂氧合酶同工酶分析、OsLOX3的基因克隆以及一个脂氧合酶基因簇的结构研究

摘要

粮食安全是一个全球性的战略问题，而粮食贮备是其中重要的一环。已经知道，稻谷在一般贮藏条件下第二年就会产生陈化变质现象，随着贮藏过程中温度和湿度的提高，陈化过程也会迅速加快。据统计，每年我国因为陈化问题损失的包括作为食用和种子的稻谷占总产量的3％。近年来的研究表明，稻谷贮藏期间脂质的降解是导致其品质下降并产生令人不快气味的主要原因之一，其中脂氧合酶(lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12)是脂质降解的关键酶。因此从理论上讲，粮食作物LOX的缺失可以明显的阻止脂质过氧化作用，减缓贮藏粮食氧化变质的速度，保持清新气味，提高耐贮性，上述推测已经在水稻LOX的主要同工酶LOX-3的缺失体与耐贮性关系的研究中得到了初步证实，但是有关LOX-3缺失体的简单筛选方法、水稻种子LOX同工酶分析、LOX-3的基因克隆以及与缺失的关系还有待于进一步的研究。 本文首先根据水稻种胚脂氧合酶-3共氧化的次生反应特性及其催化产物的氧化特性，分别建立了筛选水稻种胚LOX-3缺失体的胡萝卜素漂白比色法和I2-KI，与常用的LOX-3单克隆抗体筛选技术相比，这两种方法具有准确、快速、简单且成本低的特点，可以进一步用于耐储藏水稻的分子育种研究。 采用生物化学的手段发现，水稻种子发育过程中的LOX同工酶多态性是非常丰富的，其中存在有分子量明显小于68 kDa的LOX同工酶。根据不同的分离方法，水稻种子发育过程中的LOX同工酶至少是4-9条。与具有LOX-3活性的越光相比，采用梯度PAGE(5-20％)分析发现，LOX-3缺少品种Daw Dam的LOX缺少谱带分别属于第一和第三类，而且至少有4条谱带缺失；采用IEF(pH3.5-10)分析发现，DawDam种子成熟过程中明显缺少pI为4.56的LOX同工酶(II)；采用Westem blotting分析也发现，LOX-3缺少品种Daw Dam的LOX缺少谱带分别属于两大类。由于LOX-3缺少品种Daw Dam的LOX-3缺少并不是一个同工酶，而是缺少等电点较小的一类LOX，因此建议把种子发育过程中的LOX同工酶划分为LOX-I类、LOX-II类和LOX-III类。 进一步的免疫电镜观察发现，越光和Daw Dam的种子发育进程中，LOX蛋白并不出现在油体上，而是分布在蛋白贮藏囊泡(protein storage vacuole，PSV)的四周，因此与底物在空间上是分离的。但是在贮藏过程中，稻谷通常会自身发生细胞结构损伤和化学成分的改变，前者包括脂质体的溶合、细胞膜完整性下降、透性增加和细胞溶质功能的丧失。因此，也会导致LOX与底物的靠近，启动LOX参与的脂质过氧化，催化生成的脂氢过氧化物再被脂氢过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyases，HPLs)和脂氢过氧化物异构酶(hydroperoxide isomerases，HPIs)降解或自动氧化为具有挥发性的己醛、戊醛和戊醇等羰基类低分子化合物，从而产生与稻米陈化变质有关的陈米霉味。此外，也不排除LOX作为储藏蛋白或合成传递生物胁迫和非生物胁迫信息信号分子的可能性。 进一步克隆并报道一个新的水稻种子脂氧合酶的编码基因OsLOX3，该基因位于水稻第三染色体，并与OsLOX1/2呈基因簇排列。与OsLOX1/2相比，OsLOX3表达产物的等电点是最小的，其在染色体上的位置与本实验室耐贮性的QTL定位结果也是一致的。与OsLOX3相比，发现MiniOsLOX3在第四外元处存在有点突变，因此发生提前终止的现象，其原核表达产物的分子量为28 kDa，但是也具有一定的酶活性。最后，对位于水稻第三染色体的脂氧合酶基因簇进行了生物信息学分析，包括三维结构、结构域分布、进化树分析和表达谱等，并推测水稻种子LOX基因可能存在有可变剪接的可能性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语词汇表

声明

第一章文献综述

第一节水稻种胚脂氧合酶-3和耐贮性的关系

1 水稻种胚LOX-3的生化特性

2 水稻种胚LOX-3与贮藏的关系

3 稻谷种胚LOX-3缺失体的筛选及其遗传规律

4 展望

第二节本研究的目的意义和内容

第二章水稻种胚脂氧合酶-3缺失体的筛选方法

第一节I2-KI比色法

1 材料与方法

2 结果与讨论

第二节胡萝卜素漂白法

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章水稻种子发育过程中脂氧合酶同工酶活性、蛋白以及亚细胞分布的变化

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1水稻种子发育过程中LOX活性的变化

2.2水稻种子发育过程中LOX同工酶的变化

2.3水稻种子发育过程中LOX蛋白的变化

2.4水稻种子发育过程中LOX蛋白的免疫电子显微镜亚细胞定位

3 讨论

3.1 水稻种子发育过程中的LOX同工酶多态性

3.2 LOX-3的正常品种越光和LOX-3活性缺少的品种Daw Dam种子发育过程中的LOX同工酶差异

3.3水稻种子发育过程中LOX蛋白并非定位在油体

3.4水稻种子发育过程中LOX的可能生理作用

第四章 从水稻种胚中提取RNA的CTAB-LiCl法

1 材料与方法

2 结果与分析

第五章水稻种子脂氧合酶基因OsLOX3的克隆、序列分析与表达规律研究

1 材料与方法

2 结果与讨论

2.1 水稻OsLOX3基因全长cDNA的克隆与序列分析

2.2 OsLOX3基因启动子的克隆

2.3水稻种子发育过程中OsLOX3基因的转录本变化

第六章水稻种子脂氧合酶OsLOX3第四外元突变对其表达活性的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1目的基因编码框的PCR扩增

2.2目的基因编码框的克隆与重组子的鉴定

2.3原核表达质粒的构建及重组子的鉴定

2.4重组蛋白的SDS-PAGE分析

2.5表达载体融合蛋白的酶活性和Western blotting分析

3 讨论

第七章水稻第三染色体一个脂氧合酶基因簇的结构分析与表达差异

1 材料与方法

2 结果与讨论

2.1水稻染色体上可能的LOX基因分布

2.2水稻第三染色体BAC克隆(OSJNBb0024816)上一个脂氧合酶基因簇的结构分析

2.3水稻第三染色体BAC克隆上一个脂氧合酶基因簇推测的三个编码产物特征

2.4水稻第三染色体上一个脂氧合酶基因簇编码产物的结构域分析

2.5水稻第三染色体上一个脂氧合酶基因簇编码产物的二级和三级结构分析

2.6水稻第三染色体BAC克隆上一个脂氧合酶基因簇和同源基因的进化树分析

2.7 OsLOX1/2/3的EST分析

2.8 OsLOX可变剪切预测

2.9 OsLOX表达产物的可能功能

全文结论

创新之处

存在的问题与展望

参考文献

附图与附表

在读期间获得的专利、发表的论文

致谢