酪蛋白来源血管紧张素转化酶抑制肽的研究

摘要

在现代社会中，高血压是流行最为广泛的心血管疾病，而在高血压人群中有95％以上的患者是原发性高血压。血管紧张素转化酶是血压调节中的一个重要因子，它的抑制因子可以有效地降低血压。酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质，酪蛋白经酶水解得到的肽片段对血管紧张素转化酶具有较高的亲和力，并与其结合，从而抑制ACE的催化作用，具有降低血压的作用。并且该肽被证明主要降低原发性高血压。同时，酪蛋白及其水解得到的肽被证明具有抗氧化的活性，可以作为天然抗氧化成分添加到食品及化妆品中。
　　 活性肽一般都是以无活性的形式存在于蛋白质序列中，蛋白质通过加热、酸碱水解、蛋白酶解或微生物发酵等加工过程时，成为有功能的活性肽。加热和酸碱处理蛋白条件剧烈，会对原料造成很大的破坏，而且后处理工序繁琐，专一性不强；而酶解方法条件温和，对环境污染小，简便可靠，所以，目前生产生物活性肽普遍采用酶解法。同时，通过酶解酪蛋白生产生物活性肤，与化学合成法和基因工程方法生产生物活性肽相比，其原料廉价、成本低、安全性好。本文以胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶作为水解酪蛋白的备选用酶，选出最佳水解酶，然后以水解度和水解物体外血管紧张素转化酶抑制活性为指标对其水解条件进行优化，得到最佳水解条件下的水解产物，并对产物进行分离纯化及分析，最后研究了酪蛋白及其水解物的体外抗氧化活性。
　　 首先，对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶的活力的测定并分析了酪蛋白成分，主要是测定蛋白氮的含量，得到酪蛋白的蛋白含量约为88％。然后用三种酶在相同的条件下水解酪蛋白，通过不同时间水解度和水解物的体外对血管紧张素转化酶的抑制作用的选出最佳水解用酶进行水解反应。经过比较，三种酶中胰蛋白酶水解物无论从水解度还是ACE抑制活性上都要高于其它两种酶的水解物，因此选择胰蛋白酶作为水解用酶进行下面的研究。
　　 其次以酪蛋白为底物，用最佳水解用酶进行水解条件的优化，包括单因素试验和正交试验，确定最佳的水解条件。经过单因素试验和正交试验的分析得到最佳的水解条件为45℃，pH为7，酶与底物的比例为6/1000，底物浓度为2％，水解时间为12h。
　　 再次，进行水解物的初步分离纯化及分子量的测定。本试验选用超滤的方法进行粗分离，得到分子量小于3000道尔顿的组分。然后用聚丙烯酰胺凝胶色谱Bio-gel p2进行进一步分离并测定ACE抑制活性，该方法利用分子筛的原理将不同分子量的肽分开，再将收集的组分用高效液相色谱进行分析分离，最后用液相色谱-质谱串联分析得到的肽的分子量范围。
　　 最后对所酪蛋白及其水解物进行了抗氧化活性的研究。测定了酪蛋白及胰蛋白酶水解酪蛋白得到的水解物的抗氧化活性，包括总抗氧化能力、还原力、清除DPPH自由基的能力、清除超氧阴离子自由基的能力和螯合金属离子的能力的测定。结果显示，酪蛋白溶液、酪蛋白水解液和水解液中分子量小于3000道尔顿的组分均有一定的抗氧化活性，特别是清除DPPH自由基和螯合铁离子的效果比较好。它们的抗氧化活性都随浓度的增高而升高。其中，相同浓度下，以小分子量的组分的抗氧化活性最高，酪蛋白溶液的活性最低，水解液居中。

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引言

第一章 文献综述

1.1 血压调节机制

1.1.1 血管紧张素转化酶

1.1.2 血压调节机制

1.2 酪蛋白来源血管紧张素转化酶抑制肽的降压作用

1.2.1 酪蛋白

1.2.2 酪蛋白来源血管紧张素转化酶抑制肽

1.2.3 血管紧张素转化酶抑制肽对血压的调节作用和降压原理

1.3 血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法

1.4 血管紧张素转化酶抑制肽活性的检测

1.4.1 体外检测

1.4.2 体内检测

1.5 酪蛋白来源的肽的其它生物活性及应用

1.5.1 抗氧化肽

1.5.2 免疫调节肽

1.5.3 类阿片肽

1.5.4 抗凝血肽

1.5.5 酪蛋白磷酸肽

1.5.6 其它生物活性肽

1.6 立题背景及意义

1.7 研究内容

第二章 酶活力的测定及最佳水解用酶的选择

2.1 材料和方法

2.1.1 材料与试剂

2.1.2 仪器与设备

2.1.3 实验方法

2.2 结果与讨论

2.2.1 酪蛋白中蛋白氮含量的测定

2.2.2 酪氨酸标准曲线的绘制

2.2.3 酶活力的测定

2.2.4 牛血清白蛋白标准曲线的绘制

2.2.5 不同酶水解酪蛋白的比较

2.3 结论

第三章 胰蛋白酶水解酪蛋白的水解条件的优化

3.1 材料和方法

3.1.1 材料与试剂

3.1.2 仪器与设备

3.1.3 实验方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 单因素试验

3.2.2 水解条件的优化

3.3 结论

第四章、酪蛋白的胰蛋白酶水解物的分离纯化

4.1 材料和方法

4.1.1 材料与试剂

4.1.2 仪器与设备

4.1.3 实验方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 超滤分离

4.2.2 Bio-gel p2凝胶柱层析分离

4.2.3 高效液相色谱分析并分离

4.2.4 液相色谱-质谱分析水解得到肽的分子量

4.3 结论

第五章 酪蛋白及其水解物的抗氧化活性研究

5.1 材料和方法

5.1.1 材料与试剂

5.1.2 仪器与设备

5.1.3 实验方法

5.2 结果与讨论

5.2.1 样品总抗氧化能力

5.2.2 样品的还原力

5.2.3 样品的DPPH自由基清除能力

5.2.4 样品清除超氧阴离子的能力

5.2.5 样品螯合金属离子的能力

5.3 结论

全文结论

参考文献

硕士期间发表的论文情况

致谢