β-D-半乳糖苷酶催化合成功能糖的研究

摘要

糖类是构成生物体的重要组成成分，在自然界中分布最广泛，含量最丰富，具有最大的生物信息量。近年来，随着研究的逐渐深入，糖工程已成为继基因工程和蛋白质工程之后的最引人注目的新生物技术学科，而糖生物学则正处于这一新学科的前沿。其中，因为功能糖具有多种生物活性，有较好的经济和产业价值，更成为了糖生物学研究的一个热点。功能糖是具有低热量，能提供营养，促进和改善人体生理机能的糖（醇）类产品的统称，以功能性低聚糖、功能性糖醇等为主要代表。随着科学的发展和消费者健康意识的不断增强，具有对人体有特殊生理功能的功能糖越来越受到人们的广泛关注。功能糖作为一种安全无毒副作用，低热量，抗龋齿，防治便秘等功能性食品添加剂已经在国内外得到了广泛的应用。本文利用商品化的β-半乳糖苷酶以普通低聚糖（醇）为底物合成两种具有特殊功能的功能糖，首次发现一种新型的功能糖。
　　 第一、以乳糖为供体、山梨糖醇为受体，从多彩青霉（Penicillium multicolor）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）、米曲霉（Aspergillus oryzae），果胶酶（Pectinex UltraSP-L）中筛选出一种合适的β-D-半乳糖苷酶来催化合成反应。经HPLC法检测反应产物，结果表明来源于多彩青霉的β-D-半乳糖苷酶能有效的催化合成Gal-sorbitol。随后利用活性炭-硅藻土（1:1）层析柱和聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P2柱对产物进行分离纯化，最后利用1H-NMR、13C-NMR、ESI-TOF-MS对其结构进行鉴定，确定结构为β-Gal-（1→3）-sorbitol、这是一种乳糖醇的同分异构体。同时进一步提高产物的产率，对影响Gal-sorbitol合成的各个因素的水平（即温度、pH、底物浓度、供受体比率、酶用量）进行了优化。结果表明，供受比是影响酶合成反应产率最显著的因素。此合成的最佳条件是：60％的乳糖和山梨糖醇作为底物，pH5.0，反应温度为30℃，乳糖和山梨糖醇的比率为1:0.5，酶用量为2 U/mL，最高Gal-sorbitol的产量达到171.6 g/L。
　　 第二、以乳糖为供体、果糖为受体，从多彩青霉、环状芽孢杆菌、米曲霉，果胶酶中经过筛选出一种合适的β-D-半乳糖苷酶来催化合成反应。经HPLC检测反应产物，筛选出来源于环状芽孢杆菌的β-D-半乳糖苷酶能有效地催化合成乳酮糖。为了进一步提高产物的产率，对影响乳酮糖合成的重要因素温度、pH、底物浓度、供受比、酶用量进行了优化。试验表明，以60％（W/V）的乳糖和果糖（乳糖：果糖=2:1）作为底物，pH为6.0，反应温度为50℃，酶的用量为2U/mL为最佳反应条件。在此条件下，最高乳酮糖的产量达到71.2 g/L。

目录

文摘

英文文摘

图形索引

第一章 文献综述

1.1 功能糖的概述

1.1.1 前言

1.1.2 功能糖的种类以及应用

1.1.3 功能糖的生理功能

1.1.4 前景及其展望

1.2 β-低聚半乳糖苷酶在功能糖制备上的应用

1.2.1 β-半乳糖苷酶的性质

1.2.2 β-半乳糖苷酶的作用机理

1.2.3 β-半乳糖苷酶的应用

1.3 立题背景及意义

1.4 研究内容

第二章 酶法合成功能性糖醇

2.1 材料和方法

2.1.1 材料与试剂

2.1.2 仪器与设备

2.1.3 实验方法

2.2 结果与讨论

2.2.1 对硝基苯标准曲线的制作

2.2.2 β-半乳糖苷酶酶活力的测定

2.2.3 筛选不同种类的酶对合成产物的影响

2.2.4 酶合成反应产物的HPLC分析

2.2.5 β-D-半乳糖苷酶催化乳糖水解和产物合成动力学

2.2.6 酶合成反应产物的纯化与结构鉴定

2.2.7 酶合成反应条件的优化

2.3 结论

第三章 酶法合成乳酮糖

3.1 材料和方法

3.1.1 材料和试剂

3.1.2 仪器与设备

3.1.3 实验方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 对硝基苯标准曲线的制作

3.2.2 β-半乳糖苷酶酶活力的测定

3.2.3 筛选不同种类的酶对乳酮糖合成的影响

3.2.4 酶合成反应产物的HPLC分析

3.2.5 β-D-半乳糖苷酶催化乳糖水解和乳酮糖合成动力学

3.2.6 酶合成反应条件的优化

3.3 结论

全文结论

参考文献

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致谢