羟自由基在抑制ParA1诱导烟草过敏反应中作用的初步研究

摘要

蛋白类激发子elicitins是一类由卵菌纲的疫霉属和腐霉属真菌分泌的小分子蛋白，在非亲和性植物与疫霉、腐霉互作中起着重要的作用。低浓度elicitins就可以诱导烟草产生过敏反应（hypersensitive response，HR），并进一步诱导烟草产生系统获得性抗性等生物学效应，研究认为elicitins诱导的细胞死亡不需要氧爆发参与。Parasiticein（ParAl）是由寄生疫霉分泌的elicitin类激发子，外源表达ParAl注射烟草，也可以产生相同的生物学效应。因此，外源表达并获得单一有活性的ParAl蛋白可以用于研究植物-病原真菌互作。
　　 核黄素是一种重要的水溶性维生素。核黄素和其衍生物可以作为辅基参与生物许多以氧化-还原为特征的生理生化反应。此外它还是一种光敏物质，可以被紫外光诱发产生单线态核黄素和三线态核黄素，作为电子供体与氧气分子结合形成活性氧如超氧阴离子、过氧化氢等。活性氧在植物中也具有很重要的作用。当植物受到病原菌侵染后，氧爆发是植物响应病原菌侵染的最早期事件之一，产生的活性氧参与细胞壁加固、脂质氧化、防卫基因激活及防卫信号传递等一系列重要生理过程。本实验室发现在光照条件下核黄素与ParAl共同注射可以抑制ParAl诱导的烟草HR，本研究主要对此现象的产生机制做初步解析。
　　 1.ParAl蛋白在毕赤酵母中的表达
　　 为了获得单一有活性的ParAl蛋白，本实验室首先采用表达效率比较高的原核表达系统，但是表达的ParAl蛋白产量较低，不足以进行后续试验。根据已有研究，我们采用真核蛋白表达系统-毕赤酵母表达ParAl蛋白。我们首先构建蛋白胞内表达和胞外表达两种重组质粒（pPICZ（α）A系列），将重组质粒和相应的空载体由电击转化到野生型菌株X-33和突变菌株KM71H中，进行蛋白表达。通过对不同转化子的蛋白预表达和活性检验，结合后续蛋白纯化过程，我们选择KM71H转胞内表达载体为最后蛋白表达系统。经过镍柱纯化，我们在蛋白电泳图谱中得到了单一、清晰的蛋白电泳条带，且蛋白浓度约为75 ng/μl。在烟草上注射表达纯化的蛋白观察HR表型，结合蛋白电泳，我们认为此蛋白即是表达的目的蛋白，而且具有较高的生物学活性，稀释6000倍后仍可以在烟草上引发HR。
　　 2.核黄素抑制ParAl诱导的烟草过敏反应
　　 核黄素和ParAl共同注射烟草叶片，在持续光照24 h后，发现核黄素抑制ParAl在烟草上诱导的细胞死亡。检测核黄素注射到烟草叶片并光照1.5 h后注射位置的H2O2含量，发现该位置的H2O2含量是空白对照的约1.4倍，DAB染色得到相似结论。不同活性氧清除剂与ParAl和核黄素共同注射，catalase，抗坏血酸和还原型谷胱甘肽可以恢复核黄素对HR的抑制作用，而超氧化物歧化酶则不能恢复；但是外源H2O2与ParAl共注射，对HR的抑制效果不明显。进一步用羟自由基清除剂硫脲、腺嘌呤和组氨酸分别与ParAl和核黄素共同注射烟草叶片，都可以恢复核黄素对HR的抑制；同时外源羟自由基可以抑制ParAl诱导的HR。因此我们初步认为羟自由基影响ParAl诱导的烟草HR信号传导，从而抑制ParAl诱导的烟草HR。

目录

文摘

英文文摘

文献综述

第一章 激发子elicitins的分子特征和在植物中的信号传导机制

1.Elicitin类激发子的分子特征

2.Elicitins诱导植物过敏反应的信号传导机制

第二章 植物防卫反应中的活性氧

1.活性氧的种类及生物学特性

2.植物中的活性氧清除调节系统

3.植物防卫反应中活性氧的产生

4.植物活性氧的下游防卫信号

研究报告

第一章 ParA1蛋白在P．pastoris中的表达

摘要

1.材料和方法

2.结果和分析

3.讨论

第二章 初步解析核黄素抑制ParA1诱导的烟草过敏反应机制

摘要

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

参考文献

论文清单

致 谢