利用RNAi干扰技术研究大鼠附睾特异性基因Ces7的功能

摘要

近年来上海市分子男科学重点实验室克隆到一个附睾特异性表达基因Ces7（Rat615;R615），经序列分析表明，RAT615在氨基酸组成上与羧基酯酶(CEs)有大约50-60％的同源性，Rat615氨基酸序列中包含羧基酯酶家族（丝氨酸水解酶）中所有的保守序列，与已发现的CES7家族成员具有超过70％的同源性.在前期的工作已发现Rat615 mRNA和蛋白在附睾中特异性转录和表达，主要在附睾体部和尾部表达并分泌至附睾管腔中。实验已表明，Rat615蛋白具有胆固醇酯酶的活性。本文利用RNAi技术上进一步研究了Rat615基因的功能。方法：首先在细胞水平上筛选能够敲低Rat615表达（nt807-825和nt1878-1896）的有效siRNAs片段，然后以慢病毒为载体，在体外构建能够表达有效siRNAs载体，将其包装为重组病毒，用包装好的病毒去感染HEK293T细胞，感染后2d，用流式细胞仪及荧光显微镜检测病毒的滴度.然后将重组好的病毒注入大鼠附睾的尾部，在感染后10d后检测Rat615蛋白表达、精子获能的情况。
　　 结果：1、在细胞水平上成功筛选到两条能够敲低Rat615表达的siRNA1、siRNA2，并构建了能够表达siRNA1和siRNA2病毒载体，成功制备了Lenti/siRNAl-Rat615、Lenti/siRNA2-Rat615以及对照Lenti/siRNA-GFP病毒.
　　 2、病毒感染大鼠附睾尾部10d后，附睾尾部中Rat615蛋白以及管腔中Rat615蛋白的含量与对照组的相比明显的下降.精子的获能也得到了抑制.
　　 经结果表明，Rat615在精子运动、获能中发挥重要调节作用.所以本研究可以进一步利用RNAi敲低Rat615的动物模型来探讨Rat615的作用机制。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 文献综述

第一章 附睾的概述

1 附睾的结构和功能

2 附睾与精子成熟

3 精子形态的改变

4 精子表面成分的改变

5 附睾基因表达的特点

6 雄激素及睾丸因子对附睾的基因表达的调控

第二章 羧基酯酶基因的概述

1 羧基酯酶的表达和功能

2 羧基酯酶的特性

3 羧基酯酶的调控

4 雄性生殖系统中的羧基酯酶

第二部分 大鼠附睾特异性基因Ces7功能的研究

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及实验动物

1.2 主要试剂、工具酶

1.3 主要仪器

1.4 试验设计

1.5 RNAi片段的设计和载体的构建

1.6 回收酶切后的pLenti载体

1.7 连接

1.8 转化

1.9 小量抽提质粒

1.10 大量制备质粒

1.11 Western免疫印迹分析

1.12 Northern Blot分析

1.13 PNGase-F糖苷酶消化

1.14 Lentivirus的制备

1.15 病毒滴度的测定

1.16 细胞培养，转染

2 siRNA-CES7对精子成熟的影响

2.1 精子获能检测

2.2 精子运动检测

3 结果与分析

3.1 Ces7表达稳定敲低的SD大鼠模型的建立

3.2 Ces7敲低后对精子运动和获能的影响

4 讨论

4.1 靶基因的筛选

4.2 载体的构建

4.3 关于注射的剂量

4.4 羧基酯酶的功能

全文结论

参考文献

致谢