猪胸膜肺炎放线杆菌抗体ELISA检测试剂盒的研制及应用

摘要

猪传染性胸膜肺炎（porcinecontagiouspleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae，APP）引起的高度接触性、致死性呼吸道疾病。研究表明，与病原菌毒力相关的因子很多，包括毒素、荚膜多糖、外膜蛋白、脂多糖等，其中毒素既是主要的毒力因子，也是主要的免疫原。APP可产生4种毒素，其中ApxⅡ除血清型10外，其余血清型都能分泌此毒素；所有血清型的APP都能分泌ApxⅣ，ApxⅣ只有在APP感染宿主时才产生，而在体外培养条件下不表达。
　　 一、猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ-ELISA反应条件的优化及试剂盒的研制
　　 重组蛋白ApxⅡ表达和纯化经过改进，即在37℃，用0.8mMIPTG诱导4h；对早期建立的检测猪胸膜肺炎放线杆菌抗体的ApxⅡ-ELISA检测方法的反应条件进行优化，确定了最佳反应条件，抗原最适包被浓度为2.23μg/mL，包被时间为37℃1h后4℃过夜，封闭液为1％BSA/PBST，在37℃封闭1h。酶标二抗最适稀释浓度为1:20000。在此基础上研制成试剂盒，对其敏感性、特异性、重复性及稳定性进行测试。该试剂盒的批内和批间变异系数分别为2.52％～7.41％和2.96％～7.16％。与IHA试剂盒进行比较，符合率为86.7％。结果表明该试剂盒具有良好的特异性和敏感性，可快速准确的检测猪传染性胸膜肺炎。
　　 二、猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA试剂盒的研制
　　 重组ApxⅣ蛋白表达和纯化经过改进，即在30℃，用0.6mMIPTG诱导6h；在早期建立的猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA抗体检测方法的基础上，本研究对抗原酶标板制备工艺，酶标二抗、阴阳性血清和试剂盒的保存条件进行了测试，并组装成试剂盒。该试剂盒的批内和批间的变异系数分别为2.65％～8.40％和2.69％～11.3％；试剂盒置于-20℃至少保存9个月，4℃保存3个月。与科前ApxⅣ-ELISA检测试剂盒比较，两者的符合率为67.5％。该试剂盒能区分野毒感染和疫苗免疫猪产生的抗体。
　　 三、ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA试剂盒的应用
　　 利用研制的ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA试剂盒检测了不同日龄猪血清样品和大量临床血清样品。发现在同一批猪不同日龄采集的血清中，两种毒素抗体阳性率均呈现先降后升的趋势，用ApxⅡ-ELISA试剂盒检测时，50～60日龄猪抗体阳性率降到最低，而用ApxⅣ-ELISA检测时，90～110日龄猪抗体阳性率达到最低水平。ApxⅡ-ELISA试剂盒检出了临床样品阳性血清288份，阳性率为34.3％；ApxⅣ-ELISA试剂盒检出了阳性血清191份，阳性率为22.8％。

目录

文摘

英文文摘

第一篇 文献综述

1 病原学

2 流行病学

3 毒力因子

4 致病机理

5 病理变化

6 临床症状

7 检测技术的研究进展

8 防治策略

参考文献

第二篇 研究内容

第一章 猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅱ-ELISA反应条件的优化及试剂盒的研制

摘要

1材料和方法

2结果

3 讨论

参考文献

第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA试剂盒的研制

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA试剂盒的应用

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

附录

致 谢