三个棉花生长素信号转导途径相关基因的克隆与鉴定

摘要

棉花种植广泛，是关系国计民生的重要物资，在国民经济发展中具有重要地位。由于生长素在植物生长发育和生理反应的过程中起着重要的调控作用，生长素可以调控细胞的伸长、分裂和分化，以及植物的顶端优势、不定根的形成、植物的向性反应、果实的发育、和胚的形成等方面。因此，研究棉花生长素信号转导过程以及转导途径中的重要元件具有重要意义，同时研究棉花生长素信号转导相关的基因的生物学功能，对全面了解生长素在棉花的生长发育以及形态建成过程中所发挥的作用，以及阐明棉花中生长素信号转导的复杂分子机制具有重要的理论意义。已有的研究成果表明，生长素调控的过程更多是通过调控其它基因表达来影响植物的发育和其他的一些反应，这些被调控的基因称为生长素诱导的原初表达基因，能够被生长素诱导继而快速、特异、并且在不需要新的蛋白质生物合成的条件下表达。原初反应基因包括Aux/IAAs( auxin/indoleacetis acids proteins)、SAURs(small auxin-up RNA)和GH3等三类主要的转录因子家族。
　　 本研究利用cDNA芯片技术在棉纤维发育开花后5天(5DPA)、10天(10DPA)、15天(15DPA)、20天(20DPA)、25天(25DPA)筛选陆地棉标准系TM-1和优质抗病品种海岛棉7124的差异表达基因，克隆得到与棉花生长素信号转导途径相关的3个重要cDNA克隆，并通过Real-Time PCR( Q-PCR)验证了基因表达：
　　 (1)生长素结合蛋白ABP(auxin-binding protein, GhABP)（GenB ank登录号：AAO92740）该cDNA克隆插入片段长度为897bp，开放读码框长度为618bp，编码206个氨基酸；(2)两个生长素原初反应基因(primary auxin responsive genes)，一个属于其中的生长素/吲哚乙酸蛋白( auxin/indoleacetis acids proteins, Aux/IAAs)超家族成员，该cDNA克隆插入片段长度为1014bp，开放读码框长度为726bp，编码242个氨基酸，Blastx比对与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、蓖麻(Ricinus communis)、番薯（Ipomoeanil）等物种的IAA16都有一定相似度，因此将其命名为GhIAA16a;另一个属于生长素原初反应基因其中的SAURs( small auxin-up RNAs)转录因子家族，该cDNA克隆插入片段长度为794bp，开放读码框长度为366bp，编码122个氨基酸，Blastx比对与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米（Zea mays）等物种的SAUR基因具有一定的相似性，因此将该基因命名为GhSAUR2。
　　 采用SignalP程序对这三个基因进行了N端信号肽预测，GhSAUR2、GhIAA16a均无信号肽结构，只有GhABP具有典型的信号肽，说明只有GhABP为分泌蛋白。并且对这三个基因进行了保守区域分析等。
　　 采用实时荧光定量PCR方法(Real-time quantitative PCR)验证各基因的表达，结果与芯片基本一致。其中GhABP与GhIAA16a表达趋势相反，在棉纤维细胞伸长期（开花后10天）GhABP高量表达，而GhIAA16a表达量达最低，10天以后到25天GhABP表达量逐渐下降而GhIAA16a逐渐上升。说明GhABP基因可能是促进棉纤维发育，而GhIAA16a则和抑制棉纤维发育有关。
　　 利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉7124培育的140个BC1作图群体分别对这三个基因进行染色体定位，GhABP、GhIAA16a定位到11号染色体，GhSAUR2定位到第8号染色体。
　　 对GhABP、GhIAA16a、与GhSAUR2基因分别构建了GFP载体，然后利用基因枪法轰击洋葱表皮，亚细胞定位结果显示GhABP定位于细胞膜上，GhIAA16a基因定位于细胞核上。
　　 对GhABP、GhIAA16a与GhSAUR2基因分别构建了pBI121-35s启动子正义表达载体，准备进行转基因功能验证。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一部分 文献综述

1 棉花纤维细胞的分化和发育

1.1 纤维原始细胞分化和突起（起始期）

1.2 纤维细胞伸长期（初生细胞壁合成）

1.3 次生壁的合成（增厚期）

1.4 脱水成熟

2 生长素信号转导概述及在棉花中的研究进展

3 生长素信号转导途径的主要元件

3.1 生长素结合蛋白ABP1

3.2 Aux/IAA基因

3.3 SAUR基因

3.4 ARF基因

4 生长素信号转导途径在细胞核内的调控机制

4.1 Aux/IAA和ARF调控生长素反应机制

4.2 参与Aux/IAA蛋白泛素化降解的SCFTIR1复合体

5 实时荧光定量PCR

5.1 实时荧光定量PCR的两个重要概念

5.2 荧光定量PCR方法的主要类型和原理

5.3 荧光定量PCR的应用

6 SNP染色体定位

6.1 SNP的定义及分类

6.2 SNP标记在作物育种中的应用

第二部分 研究报告

引言

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2．结果与分析

2.1 GhABP基因的克隆和研究

2.2 GhIAA16a基因的克隆和研究

2.3 GhSA UR2基因的克隆和研究

3 讨论

3.1 GhABP基因在棉花中作为生长素受体的作用

3.2 GhIAA16a基因抑制棉纤维发育的机制

3.3 GhSA UR2基因的生物学功能

全文结论

参考文献

附录

致谢