棉花中三个激素相关基因的克隆与鉴定

摘要

棉花是世界上最重要的纤维作物和重要的油料作物之一。棉纤维是己知纤维素纯度最高的天然资源之一，在世界纺织工业中具有重要的经济地位。棉花的生长和棉纤维的发育都离不开植物激素的调节，激素在棉花的整个生长发育过程中起着非常重要的作用。因此棉花中激素酶类基因的克隆既有助于植物细胞发育分子机理的阐明，也为棉纤维发育的生物学研究打下基础。 本研究从优质材料7235不同棉纤维发育混合cDNA文库中分离出三个cDNA克隆。其中一个克隆编码腺苷高半胱氨酸水解酶(命名为GhSAHH)。反义表达该基因可以增加细胞中游离的细胞分裂素的含量，诱导植物抗逆性防御。该cDNA克隆插入片段长度为1598bp，利用5’RACE技术得到上游318bp的片段，与原序列拼接后，得到一1916bp的cDNA序列。其开放读码框长度为1458bp，编码485个氨基酸，编码产物理论分子量约为53.2kDa，理论等电点为5.69，ORF上游具同框终止子。该氨基酸序列无信号肽序列，故可能是胞内酶。BLAST‘结果表明，与来源于其他植物的这类腺苷高半胱氨酸水解酶基因有较高的同源性，GhSAHH与紫花苜蓿(Medicago sativa)腺苷高半胱氨酸水解酶(GenBank登录号：ALFMSA2S)之间一致性为83％。从表达特征上来看GhSAHH呈组成性表达，其在根、茎、叶中均有表达，而在纤维发育早期表达量较高，后期表达量逐渐降低。Southem杂交结果表明GhSAHH基因在陆地棉基因组中可能为单拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的140个BC<,1>作图群体，将GhSAHH定位在染色体20上。淹水胁迫下，GhSAHH在棉花叶片中下调表达，诱导植物抗逆性防御。 第二个克隆编码生长素应答蛋白(命名为GhARP)。该基因编码产物是生长素信号转导的早期响应蛋白。该cDNA克隆插入片段长度1696bp，其开放读码框编码长度为1074bp，编码357个氨基酸，编码产物理论分子量约为38.9kDa．，理论等电点为6.62。该氨基酸序列无信号肽序列，故可能是胞内酶。BIAsT结果表明，与来源于其他植物的这类生长素应答蛋白基因有较高的同源性，GhARP与葡萄(Vitis vinifera)生长素应答蛋白(GenBank登录号：．AY082522)之间一致性为85％。从表达特征上来看GhARP属棉花细胞组成性表达，其在根、茎、叶及棉纤维各时期都表达量较高，看不出明显差异。Southem．杂交结果表明GhARP基因在陆地棉基因组中可能存在多个拷贝。已将GhARP正反义片段构建入CaMV35S的植物表达载体pBIl21，正进行棉花的转基因研究。淹水胁迫下，GhARP在棉花叶片中表达量在胁迫后六天达最大值，随后逐渐降低。第三个克隆编码乙烯应答元件结合蛋白(命名为GlaEREBP)。该基因编码产物是乙烯信号转导过程中的一个重要调控蛋白。该cDNA克隆插入片段长度1563bp，其开放读码框编码长度为1191bp，编码396个氨基酸，编码产物理论分子量约为38．9kDa，理论等电点为6.62。该氨基酸序列无信号肽序列，故可能是胞内酶。BLAST结果表明，与来源于其他植物的这类乙烯应答元件结合蛋白基因有较高的同源性，GhEREBP与陆地棉(Gossypium hirsutum)的乙烯应答元件结合蛋白(GenBank登录号：AY817134)之间一致性为96％。从表达特征上来看GhEREBP属纤维细胞优势表达，其在根、茎、叶中均有表达，而在纤维发育早期表达量较低，纤维伸长发育期表达量较高。Southem杂交结果表明GhEREBP基因在陆地棉基因组中可能存在多个拷贝。将GhEREBP正反义片段构建入CaMV35S的植物表达载体pBIl21，正进行棉花的转基因研究。淹水胁迫下，GhEREBP在棉花叶片中表达量没有明显变化。

目录

文摘

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第一部分文献综述

1棉花纤维的生长发育过程

2植物激素的种类及其在植物体中所起的作用

3.激素在棉花纤维发育中含量的变化及对其分化和发育的影响

3.1激素在棉花纤维发育过程中含量的变化

3.2激素对棉花纤维分化和发育的影响

4.生长素、细胞分裂素和乙烯的分子生物学研究进展

4.1生长素的分子生物学研究进展

4.2细胞分裂素的分子生物学研究进展

4.3乙烯的分子生物学研究进展

5.植物激素与植物抗逆性的关系

5.1 ABA与植物逆境的关系

5.2乙烯与植物抗逆性的关系

5.3细胞分裂素在植物抗逆性中的作用

6.RACE技术在植物基因克隆上的应用

7.水分胁迫对棉花的影响

7.1水分胁迫条件下的棉花的生理变化

8.本研究的目的和意义

第二部分研究报告

1.实验材料

1.1植物材料

1.2菌种和质粒

1.3基因来源

1.4试剂

1.5引物合成

2.实验方法

2.1棉花RNA的提取

2.2甲醛-琼脂糖凝胶电泳

2.3 5'RACE步骤

2.4扩增产物的电泳，回收，克隆及测序

2.5 RT-PCR

2.6棉花基因组DNA的提取

2.7 Southern杂交分析

2.8定位分析

2.9植物表达载体的构建

2.10 Unigene文库的获得及序列分析

2.11水分胁迫下所克隆基因在棉花叶片中表达量的变化

3结果与讨论

3.1 EST序列的获得及初步分析

3.2 GhSAHH基因的克隆和鉴定

3.3 GhARP基因的克隆和鉴定

3.4 GhEREBP基因的克隆和鉴定

3.5其他克隆的表达谱分析

全文结论

参考文献

致 谢