StFT和StAP1的克隆及反义CONSTANS马铃薯植株块茎形成分析

摘要

马铃薯（Solanum tuberosum L.）作为主要栽培作物之一，在农业生产上占据重要地位。在马铃薯育种上，产量改良是主要目标，因此研究马铃薯块茎形成的调控机制具有重要意义。以往的研究表明，马铃薯块茎诱导的光周期调控和开花调控具有相似性。进一步的研究发现，拟南芥CONSTANS（AtCD）基因对块茎的形成有负调节作用，然而，迄今为止马铃薯StCOL在块茎形成中作用机制仍不清楚。FT和APl在植物的开花调控中是CO下游基因，本研究在分析反义StCOL转基因马铃薯块茎形成的基础上，采用同源克隆方法从马铃薯中克隆了StFT和StAPl基因，并研究了它们的表达特征。主要研究结果如下：
　　 1.采用RT-PCR和PCR方法克隆了一个马铃薯StFTcDNA序列（GU223211）及DNA序列，该基因由三个内含子，四个外显子构成。StFTcDNA序列含有一个522 bp的开放阅读框，编码一个173个氨基酸残基构成的蛋白，分子量为19.75 kDa，等电点为7.76。StFT蛋白含有一个高度保守的PBP结构区域，与拟南芥的FT同源蛋白具有较高一致性。半定量PCR分析结果显示，StFTmRNA在马铃薯的叶片、顶芽、花和膨大匍匐茎中有较高水平的表达。
　　 2.采用RT-PCR方法克隆了马铃薯StAP1cDNA序列（GU220568）。该基因cDNA含一个735 bp的完整开放阅读框，编码一个由244个氨基酸残基组成的蛋白，分子量为28.57 kDa，等电点为8.32。StAPl蛋白含有一个高度保守的MADS结构域，与烟草NAPl具有较高一致性。组织表达分析显示，StAP1在马铃薯植株的顶芽、花、叶片有较高水平的转录表达，在块茎中有微量表达。
　　 3.对反义StCOL转基因马铃薯中PCR阳性的5个株系进行Southern杂交验证，3个株系有杂交信号，表明反义StCOL基因片段已经整合到转基因植株基因组中。转基因株系无论在长日照还是短日照条件下种植，块茎形成产量都优于对照，证实StCOL对茎形成具有负调控作用。进一步分析了反义StCOL转基因马铃薯植株中StFT和StAP1 mRNA表达水平，二者均比对照明显地降低，表明在块茎形成过程中StFT和StAP1受StCOL的调控，可能位于StCOL基因的下游。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表及其英汉对照

前 言

第一章 文献综述

第一节 马铃薯的块茎形成、影响因素及其相关基因的表达

1 块茎形成的过程

2 影响块茎形成的主要因素

3 块茎发育过程中相关基因的表达

第二节 马铃薯块苇形成光周期调控研究

1．光周期反应的类型

2．PHYB介导的马铃薯块茎形成光周期诱导途径

3．CO同源基因参与块茎膨大的调节

4．FT同源基因是块茎形成的整合因子

5．AP1同源基因与块茎的形成

第二章 马铃薯StFT基因的克隆与表达分析

1．材料与方法

1.1 试验材料

1.2 总RNA的提取与cDNA第一链的合成

1.3 StFT cDNA全长的扩增

1.4 StFT基因生物信息学分析

1.5 基因表达半定量RT-PCR分析

2 结果与分析

2.1 RNA的提取与检测

2.2 StFT基因的克隆

2.3 StFT的生物信息学分析

2.3 StFT的组织表达特性

3 讨论

第三章 马铃薯StAP1基因的克隆与表达分析

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 总RNA的提取与cDNA第一链的合成

1.3 StAP1 cDNA全长的扩增

1.4 StAP1基因生物信息学分析

1.5 基因表达半定量RT-PCR分析

2 结果与分析

2.1 StAP1基因的克隆

2.2 StAP1的生物信息学分析

2.3 StAP1的组织表达特性

3 讨论

第四章 反义StCOL转基因马铃薯块茎形成分析

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 转基因植株的Southern blot检测

1.3 块茎产量分析

1.4 叶绿素含量和薯块淀粉含量测定

1.5 StFT和StAP1基因的表达分析

2 结果与分析

2.1 转基因马铃薯的Southern blot鉴定

2.2 转基因马铃薯结薯分析

2.3 转基因马铃薯植株形态学分析

2.4 转基因马铃薯植株叶片叶绿素含量和薯块淀粉含量分析

2.5 转基因马铃薯StFT和StAP1基因的表达分析

3 讨论

全文结论

参考文献

附 录

攻读硕士学位期间发表的研究论文

致 谢