鲤TRAP分子标记筛选及其遗传多样性分析

摘要

由美国农业部北方作物科学实验室Hu与Vick于2003年提出的目标区域扩增多态性(target region amplified polymorphism,TRAP)也叫靶位区域扩增多样性,是一个基于PCR的标记技术。它易于建立,同时又具有重复性好、效率高等特点。相比其他分子标记技术,TRAP标记技术具有许多优势。首先它像RAPD技术一样容易建立,同时又能产生出与AFLP技术相媲美的图谱。其次,TRAP标记技术能够利用生物信息工具和EST数据库信息,产生目标候选基因区多态性标记。这一技术已成功应用于许多农作物的遗传图谱构建、重要性状分子标记筛选、种质资源多样性研究和标记辅助选择育种中。目前,在鲤遗传结构的研究中主要应用的标记有SSR标记和RAPD标记等,尚未见到应用TRAP标记技术分析鲤遗传结构的相关报道。因此,本研究将这一新型分子标记运用到鲤遗传育种研究中。
　　 针对鲤这一主要水产养殖品种设计了TRAP分子标记的反应体系。初步确定适合鲤TRAP反应体系:在15μl PCR反应体系中,Mg2+浓度为1.5 mmol/L、dNTPs浓度为0.35 mmol/L、随机引物浓度均为6 pmol/L、固定引物浓度为10 pmol/L、含DNA模板60 ng、Taq DNA聚合酶1.0 U。扩增反应包括:94℃4 min,1个循环;94℃45 s,35℃45 s,72℃1 min,5个循环；94℃45 s,53℃45 s,72℃1 min,35个循环;72℃10 min,1个循环,4℃保存。运用这一优化反应体系,选取10个多态性较好的引物组合对建鲤、黄河鲤、黑龙江野鲤、兴国红鲤和荷包红鲤等5个鲤群体进行遗传多样性进行分析。结果表明,共扩增出168个位点,其中多态性位点134个,平均多态性比率80.41％,平均多态性信息含量0.29。分子变异方差分析(AMOVA)表明鲤群体遗传遗传多样性主要存在于群体内个体间(96.97％),只有3.03％遗传变异存在于群体间。基于目标候选基因TRAP标记的聚类结果能够在一定程度上反映了鲤群体间的亲缘关系。
　　 应用TRAP分子标记对建鲤、黄河鲤和鲤改良品系进行遗传多样性分析,筛选出28个多态性较好的引物组合,共扩增出409个位点,其中多态性位点312个,平均多态性比率75.51％,平均多态性信息含量0.27。建鲤、黄河鲤和建鲤改良品系平均期望杂合度分别为0.2236、0.2261和0.2533；遗传多样性指数分别为0.2103、0.2076和0.2423；群体内多态位点比例分别为65.09％、61.37％和65.22％；遗传相似度和遗传距离结果表明,鲤改良品系继承了更多建鲤的遗传物质。同时研究发现引物组合为Me7+Eml,在200bp左右,鲤改良系有一条明显的特异带,而原始亲本建鲤和黄河鲤中则没有；引物组合为Me18+Em2,在220bp左右,黄河鲤有一条明显的特异带,而建鲤和鲤改良品系均没有。
　　 另外,针对可能与鲤生长性状相关的目标候选基因设计TRAP固定引物,利用25个TRAP分子标记对建鲤选育群体进行遗传多样性分析,同时将初步筛选出的3个与生长性状相关TRAP分子标记位点对群体进行位点性状问的关联分析.结果表明,25个TRAP分子标记共扩增出353个位点,其中多态性位点230个,平均多态性比率65％,平均多态性信含量为0.28,Nei遗传多样性指数平均值为0.2193,Shannon信息指数平均值为0.3289,表明该群体遗传多样性处于中等水平。在初步筛选出的3个TRAP位点(gh1 Trap04-140、4rTrap04—308、igf4Ga5-135)中,只有4rTrap04—308与体重、体长呈极显著相关(P<0.01)。本研究首次利用TRAP这一新型分子标记,初步寻找出一个可能与鲤生长性状相关的功能基因位点,为鲤重要生长性状的QTL(数量性状基因座)定位和分子标记辅助育种提供了一定的依据。