地克珠利对柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子甘油醛-3-磷酸脱氢酶的影响

摘要

鸡球虫病是由一种或多种艾美耳属的单细胞球虫寄生于鸡的肠道不同部位所引起的一种肠道细胞内寄生性原虫病,给养殖业造成巨大的经济损失。至今为止,已知最为常见的艾美耳球虫有7种,其中柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的致病力最强。目前控制球虫病的主要方法还是药物防治,但是药物长期使用后不可避免的就会产生耐药性,所以迫切需要寻找药物靶标研发新的抗球虫药.现阶段使用最多疗效最好的抗球虫药为地克珠利,而到目前为止对其作用机制尚不明确。本实验室前期工作基因芯片和SSH技术的结果显示,地克珠利对E.tenella第二代裂殖子3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)有影响,所以本研究通过人工接种鸡E.tenella孢子化卵囊,分别建立感染组(接种卵囊+正常饲料)和地克珠利组(接种卵囊+1mg/kg地克珠利饲料)球虫感染模型,地克珠利添加时间为接种后第96 h到120 h,采用荧光定量PCR、Western-blot等技术研究地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH(mz-GAPDH)mRNA和蛋白表达量的影响。具体研究内容如下:
　　 1 E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因的克隆及分析
　　 在本实验室前期工作提供的mz-GAPDH部分编码框的基础之上,利用反转录PCR、PCR酶切鉴定和基因测序等技术对mz-GAPDH的部分编码框进行了克隆扩增,得到其编码框全长。并利用生物信息学软件对其结构进行了分析预测。结果表明:mz-GAPDH基因编码框为1020 bp,编码的GAPDH蛋白由339个氨基酸组成,分子量为36.38 KDa。结构功能域包括结合辅酶NAD+的N端和与底物结合发生催化功能的C端。BLAST结果表明,mz-GAPDH与刚地弓形虫GAPDH高度同源。
　　 2 GAPDH基因的表达、表达条件的优化及酶活性分析
　　 将获得的mz-GAPDH的完全编码框连接到表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pET-28a-mz-GAPDH,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过降低温度、诱导剂的浓度和摇床的转数使融合蛋白在上清中大量表达,表达产物以His·Bind()Kit试剂盒进行纯化,紫外分光光度法对重组蛋白的酶活性进行分析,ELISA检测多克隆抗体的效价。结果显示:在IPTG为1 mmol/L、温度37℃条件下,mz-GAPDH以融合蛋白的形式在大肠杆菌菌中高效表达,表达产物以包涵体形式存在。通过对温度、IPTG浓度、摇床转速等条件的改变,最终确定其融合蛋白在上清中大量表达的最优条件为20℃、IPTG为0.1 mmol/L、摇床转数为120rpm/min和LB培养基pH为7.0.重组蛋白具有酶活性,多克隆抗体的效价可以达到1:20000。
　　 3地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因mRNA转录及蛋白表达的影响
　　 采用荧光定量PCR和反转录PCR分析地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因mRNA表达的影响,应用Western-blot检测地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因蛋白表达量的影响.结果显示:地克珠利对mz-GAPDH基因mRNA转录水平上没有显著影响,而在蛋白水平上地克珠利作用后蛋白表达量上升了110％(P<0.01)。
　　 4地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH的免疫定位及酶活性的影响
　　 采用透射电子显微镜观察地克珠利E.tenella第二代裂殖子超微结构的影响,采用免疫荧光检测分析了地克珠利对mz-GAPDH在细胞内分布的影响,应用紫外分光光度法检测了地克珠利对mz-GAPDH酶活性的影响。结果表明:地克珠利组E.tenella第二代裂殖子细胞核染色质明显减少,发生异染色质化,凝集成大的团块、与核膜分离并发生趋边化,染色质固缩边集在核膜四周呈新月状小体,出现细胞凋亡的典型特征.同时发现地克珠利作用后GAPDH在细胞核出现了大量聚集.而且地克珠利作用后酶活性显著提高(P<0.01),提示GAPDH参与了地克珠利介导的裂殖子的细胞凋亡,这有可能是地克珠利抗球虫的作用机理之一。