犬钩端螺旋体分离鉴定及其外膜蛋白基因的克隆与序列分析

摘要

犬钩端螺旋体病是由各种不同型别的致病性钩端螺旋体引起的犬急性传染病,死亡率较高,对养犬业危害性较大。警犬在工作中,接触环境较复杂,极易感染钩端螺旋体,导致工作性能下降,甚至威胁带犬民警的身体健康。目前用于预防犬钩端螺旋体病疫苗其免疫期短、免疫保护效应不完全。因此研究钩端螺旋体新型疫苗,有着重要的现实意义；而钩端螺旋体的外膜蛋白OmpL1作为致病性钩端螺旋体的标记,基因序列保守,由于位置和功能的重要性有可能成为研制钩端螺旋体基因疫苗的候选抗原。
　　 本研究项目对浙江省疑似患钩端螺旋体病的警犬进行临床症状观察和病例剖检,采集病犬尿液,在暗视野显微镜下初步检测病原体后,接种于改良Korthof培养基进行分离培养。病犬血清与犬型钩端螺旋体显微凝集试验阳性。通过分析已发表的钩端螺旋体外膜蛋白OmpL1基因序列,设计并合成了扩增OmpL1基因的一对特异引物。对分离到的钩端螺旋体和病料进行PCR扩增鉴定,均得到了与预期值相符的约960 bp的特异条带,同时将扩增得的OmpL1基因克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了重组质粒pVAX1-OmpL1,得到的重组质粒进行双酶切鉴定,并对外膜蛋白OmpL1基因序列测定与分析。
　　 本试验通过病原分离培养,分离得到一株钩端螺旋体菌株,经PCR检测和血清学鉴定为犬型钩端螺旋体,并对该致病钩端螺旋体的外膜蛋白OmpL1进行了克隆和序列分析,为今后钩端螺旋体基因疫苗的研究奠定了基础。