柔嫩艾美耳球虫菱形蛋白样蛋白酶(EtROMs)基因的克隆不及不同发育阶段转录水平研究

摘要

菱形蛋白样蛋白酶(Raomboid-like Proteases,ROMs)是一类在真核和大多数原核生物中高度保守的跨膜丝氨酸蛋白酶。该酶为罕见的多起源酶,能够在接近胞膜跨膜区或膜内将蛋白水解为多肽释放,而催化活性的发挥依赖于镶嵌在膜表面以下的亲水催化中心。研究结果表明ROMs功能涉及不同物种的多个方面,如细胞内生长因子的信号传递过程、细菌的群体敏感性产生、真核生物线粒体膜的融合、正常细胞的凋亡、顶复门原虫宿主入侵及真核生物干细胞分化等。目前,ROMs在顶复门原虫中的大部分功能还没有鉴定出来,但是ROMs在虫体入侵宿主过程中加工、成熟微线蛋白、顶膜抗原等细胞表面粘附分子。辅助虫体入侵直至纳虫空泡膜形成的作用已被证实。
　　 本研究利用生物信息学和比较基因组学技术注释拼接获得柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的三种ROMs基因序列,包括EtROM1、EtROM全长ORF序列和EtROM4部分序列。根据预测序列设计特异性引物,以E.tenella(广东株)子孢子总RNA为模板。用RT-PCR的方法成功扩增出EtRoM1、EtROM3和EtROM4的ORF序列。测序结果表明EtROM1 ORF序列全长864 bp,编码287 aa:EtROM3 ORF序列全长774 bp,编码257 aa； EtROM4全长ORF序列为1677 bp,编码558 aa。然后对扩增得到的EtROM1、EtROM3和EtROM4进行生物信息学分析,结果表明三者均存在完整的Raomboid Superfamily保守结构域和作为ROMs蛋白酶家族成员特异性的7个跨膜区结构.与其它顶复门原虫ROMs蛋白质序列的相似性在21％-60％之间。
　　 利用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法对EtROM1,EtROM3和EtROM4基因在柔嫩艾美尔球虫不同发育阶段的转录水平进行检测。提取E.tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子四个时期的总RNA,将其反转录为cDNA后做模板,以Etactin为参照基因,对EtROM1、EtROM3和EtROM4三个基因进行real-time PCR扩增,结果显示三个基因均在子孢子阶段转录水平最高,未孢子化卵囊阶段最低,表明他们均在子孢子阶段大量分泌,提示其功能与子孢子宿主细胞入侵过程有关。其中,EtROM1和EtROM4两个基因的转录水平总体趋势一致,子孢子阶段达到顶峰且分别为裂殖子时期的20.11和20.58倍,未孢子化卵囊阶段最低,孢子化卵囊与裂殖子期大致相同,说明了它们主要在子孢子阶段发挥作用。与EtROM1和EtROM4两个基因不同的是EtROM3在孢子化卵囊阶段的转录水平是裂殖子阶段的15.24倍,表明EROM3在球虫卵囊的孢子化阶段发挥作用。