鸡柔嫩艾美耳球虫表达序列标签和不同发育阶段基因表达谱分析

摘要

鸡球虫属于具有顶复合器的原生动物，寄生于鸡的肠上皮细胞内，常常引起大批鸡只的死亡，因此鸡球虫病对养禽业的危害是巨大的。本文用球虫的四个发育阶段的样品经反转录后分别与cDNA阵列进行杂交，分析了在不同发育阶段中基因的表达情况，筛选出一些与发育相关的基因。 以柔嫩艾美耳球虫敏感株和抗马杜霉素株(由敏感株诱导)各四个发育阶段即未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子为材料，构建了具有不同发育阶段和具有不同表型的混合cDNA文库。根据细菌计数法推断cDNA文库浓度约为1.83×10<'5>个细菌/ml。文库细菌培养液均匀涂布于麦康凯平板上，检测重组率约为80％。对随机挑选的200个cDNA克隆进行PCR扩增，获得137个特异性扩增产物，用1％琼脂糖电泳检测插入片段的大小，文库随机插入外源cDNA片段的平均长度约为1Kb。根据对文库的质量鉴定，能够满足后续分析的需要。 从这个混合文库中随机挑取9600个克隆进行大规模3’端测序，经生物信息学分析，获得2806条3’端高质量的表达序列标签(ESTs)，拼接出1424个假定独立转录本(TUTS)。与UniProt数据库的BLASTx结果显示：共1191个TUTs没有明显同源性而被鉴定为未知基因，约占总TUTs总数的83.6％。文库1424个TUTs的BLASTn比对结果表明：约83.2％独立基因(TUTs)与鸡柔嫩艾美耳球虫Houghton株基因组序列有同源性匹配(E value<10<'-5>)。根据与GenBank中dbEST数据库中柔嫩艾美耳球虫的EST序列进行比对获得了811个TUTS做为文库的特有基因；共有84个TUTS与刚地弓形体的独立基因具有同源性匹配(E值≤10<'-5>)。 在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子发育时期，共鉴定出484个特异表达的基因(P<0.01，倍数变化>2)。荧光定量PCR分析验证了cDNA阵列数据的可靠性。经过对不同发育时期的基因表达谱分析，在未孢子化卵囊阶段和孢子化卵囊阶段的代谢水平要远远低于子孢子阶段和裂殖子阶段。可以推测出在球虫的发育过程中存在肌醇磷脂信号通路，成纤维细胞生长因子与受体结合之后导致IP<,3>表达量增高，IP<,3>在细胞内动员内源Ca<'2+>，将储存在内质网中的Ca<'2+>释放到细胞质基质中，使胞质中游离Ca<'2+>浓度升高，加之热激刺激以及厌氧生活均可以使虫体细胞内Ca<'2+>浓度升高，最终导致微线分泌MIC2增多，这样有利于子孢子和裂殖子入侵宿主细胞。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩写词及中文对照

声明

第一章文献综述

第二章鸡柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1鸡柔嫩艾美耳球虫不同发育时期的样品

2.2总RNA提取和cDNA文库构建

2.3 cDNA文库的质量鉴定

3讨论

4小结

第三章鸡柔嫩艾美耳球虫表达序列标签(EST)研究

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1测序结果

2.2序列提交

2.3 TUT功能注释和分类

2.4高丰度表达基因

3.讨论

3.1柔嫩艾美耳球虫EST数据库

3.2有关BLAST的情况

4小结

第四章鸡柔嫩艾美耳球虫发育相关基因的cDNA阵列检测研究

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1杂交信号分析

22 cDNA阵列数据分析

2.3不同发育阶段荧光定量PCR的验证

2.4四个发育阶段特异表达基因的功能分析

2.5 K-mean均值聚类的结果

3.讨论

3.1糖代谢相关基因：

3.2入侵相关基因

3.3维持细胞形态的基因

3.4细胞信号转导相关基因

4小结

总结

参考文献

致谢

附录

作者简介