组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A对猪卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响

摘要

颗粒细胞是卵巢中十分重要的体细胞,其在发育的不同阶段合成和分泌激素以及多种生长因子,并通过自分泌或旁分泌途径发挥作用。颗粒细胞对卵母细胞成熟、卵泡发育有至关重要的作用。颗粒细胞的凋亡是导致卵泡闭锁的很重要的原因。如果一个发育卵泡中10％以上的颗粒细胞发生凋亡,则表明该卵泡已经或正在闭锁。曲古抑菌素A是一种重要的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,近年来研究发现,其对多种肿瘤细胞具有抑制作用,作用机理包括诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期和促进细胞分化等。组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为一种非常有前景的抗肿瘤药物,其对机体正常细胞的作用尚待研究。因此,本试验以TSA为代表药物,研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂对猪卵巢颗粒细胞的作用,并就其机理作初步探讨,以为临床用药提供一定的参考。具体研究内容如下。
　　 采用MTT法测定组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对猪卵巢颗粒细胞活性的影响。结果显示:TSA在低浓度时(10ng/mL以下)对猪卵巢颗粒细胞的生长没有影响,但随着药物浓度的增加,猪卵巢颗粒细胞的生长受到抑制(P<0.05),且这种抑制作用具有剂量依赖性。在10ng/mL和200ng/mL,时,随着处理时间的延长,在48h时略有升高,而在72h时又降低,但各时间点测定的OD550值差异不显著(P>0.05),表明TSA对猪卵巢颗粒细胞生长抑制不具有时间依赖性。
　　 利用间接免疫荧光研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对正常猪卵巢颗粒细胞乙酰化水平的影响,并利用荧光定量PCR技术从分子水平对机制做进一步研究。间接免疫荧光结果显示,200 ng/mL TSA处理的颗粒细胞与对照组比较组蛋白H3乙酰化水平变化显著,而在低浓度下(10 ng/mL)变化不显著。荧光定量PCR结果显示,200ng/mLTSA处理24h,Hadc-1、Hadc-3和p300 mRNA表达与空白对照组比较差异显著(P<0.05),在低浓度(10 ng/mL)时,差异不显著(P>0.05)。表明TSA在较高浓度下影响正常颗粒细胞的乙酰化水平,而在低浓度下对颗粒细胞乙酰化水平不产生影响。
　　 采用流式细胞仪检测不同浓度曲古抑菌素A(TSA)作用于颗粒细胞24h后,颗粒细胞凋亡率的变化,以确定凋亡是否为TSA作用后颗粒细胞生长抑制的机制。结果显示:200ng/m TSA处理组的细胞凋亡率为13.7％,高于空白对照组9.1％,差异显著(P<0.05)；10ng/mL处理组与空白对照相比,凋亡率无明显差异(P>0.05),表明高浓度TSA促进颗粒细胞活性凋亡,细胞凋亡是颗粒细胞活性的影响方式之一。
　　 采用流式细胞仪检测不同浓度曲古抑菌素A(TSA)作用于颗粒细胞24h后,颗粒细胞周期的变化情况,并利用荧光定量RT-PCR技术从分子水平对细胞周期相关基因进行研究。流式细胞术结果显示:与空白对照组相比,200 ng/mL TSA处理24 h后,G0/G1期细胞百分比有明显的上升(P<0.05),S期细胞百分比显著降低(P<0.05),G2/M期细胞百分比差异不显著。而低浓度(10 ng/mL)处理各期细胞百分比无明显变化。同样,荧光定量PCR结果显示,与空白对照组比较,200 ng/mL TSA处理24 h,Cyclin D2和CDK4 mRNA有明显变化,差异显著(P<0.05),而在低浓度下(10ng/mL),Cyclin D2和CDK4 mRNA的表达差异不显著(P>0.05)。表明颗粒细胞用200 ng/mL TSA处理后,细胞周期被阻滞在G0/G1期,Cyclin D2和CDK4基因表达的显著降低可能是周期阻滞的重要原因。