表达猪链球菌2型保护性抗原重组猪痘病毒的构建、特性分析及其小鼠免疫评估

摘要

猪链球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）可引起猪患脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎及败血症，同时也能感染人并导致死亡，是一种重要的人畜共患病病原体。猪痘病毒（Swinepox virus，SPV）在自然情况下只感染猪，并且症状温和，能自行康复，其作为病毒载体有很多优点，故适合用于重组疫苗的开发。本研究以SPV作为载体构建了6个表达SS2保护性抗原的重组病毒，并对重组病毒进行了免疫学评价。
　　 1. SPV的分离及猪痘的血清学调查
　　 用PK-15细胞在猪痘发病猪的痂皮和脓疱中分离到一株SPV。对包含SPV特异性序列在内的三段核酸序列进行了扩增和测序，与SPV17077-99株相比，三段序列的核苷酸同源性分别为91％、96％和99％。此外，为了了解猪痘的流行现状，利用琼脂扩散试验对来自江西、安徽、湖北、江苏、广东及上海共1004份成年猪血清进行了猪痘血清学调查。结果表明，猪痘在猪群中较少发生，在被检测的1004份样品中只有40份阳性，阳性率仅为4％,但被调查的六个地区都有分布。
　　 2.表达lacZ基因重组猪痘病毒的构建及其生物学特性研究
　　 为了验证两个痘苗病毒（Vaccinia virus，VV）强启动子P11和P28在重组猪痘病毒中的活性，构建了一个载体系统。利用这个系统获得了两个重组猪痘病毒rSPV-Z11和rSPV-Z28，并对这两个重组病毒的生物学特性进行了研究。在这个系统中，SPV基因组中SPV020和SPV021两基因间的366bp非编码区作为产生重组猪痘病毒的一个新的外源基因插入位点，大肠杆菌的lacZ基因作为一个显性筛选标记。获得的重组病毒用PCR和SDS-PAGE进行了鉴定，并对重组病毒在PK-15细胞中的增殖能力和亲本毒株进行了比较，同时我们也分析了重组病毒的遗传稳定性。结果显示，lacZ基因在重组病毒中稳定存在并能得到有效表达，重组病毒的滴度及蚀斑大小和亲本病毒差异不大，说明重组病毒性状稳定，该366bp非编码区的部分删除对病毒增殖影响不大，并且启动子P11和P28在重组病毒中有很强的活性，适合用于构建疫苗用的重组猪痘病毒。
　　 3.表达绿色荧光蛋白的重组猪痘病毒的构建及其在鼠源细胞系中的复制和表达
　　 为了探讨小鼠作为猪痘病毒载体疫苗免疫学评价模型的可能性，构建了一个表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的重组猪痘病毒rSPV-G28，并对重组病毒在鼠源细胞系LLC和Hepa1-6中的复制和表达情况进行了研究。结果显示，rSPV-G28在这两个鼠源细胞中能够有效表达绿色荧光蛋白，并且重组病毒能在LLC细胞中复制并产生子代病毒，表明小鼠可作为猪痘病毒载体疫苗免疫学评价的动物模型。
　　 4.表达猪链球菌2型mrp基因片段的重组猪痘病毒的构建及免疫学评价
　　 为了探讨SPV作为链球菌疫苗载体的潜力，构建了一个用于获得表达外源基因的重组猪痘病毒的载体系统，并用这个系统得到了一个表达猪链球菌2型mrp基因片段的重组猪痘病毒rSPV-MRP。通过PCR、western blotting和间接免疫荧光检测对rSPV-MRP进行了鉴定。经肌肉注射，分别用rSPV-MRP、SS2灭活疫苗（阳性对照）、SPV亲本病毒（阴性对照）及PBS（空白对照）给CD1小鼠免疫3次。在最后一次免疫后的第14天，用致死剂量或亚致死剂量的SS2强毒菌株ZY05719攻击CD1小鼠。结果显示，rSPV-MRP免疫组60％的小鼠存活，显著高于阴性对照组(P＜0.05)。并且，rSPV-MRP免疫组的小鼠各器官细菌含量显著低于阴性对照组（P＜0.05）。rSPV-MRP免疫组的MRP特异性抗体滴度在检测的所有时间点都显著高于对照组(P＜0.001)。这些数据表明，rSPV-MRP能显著保护CD1小鼠抵抗SS2强毒菌株的感染。因此，重组猪痘病毒有望成为猪链球菌疫苗用于预防猪发生链球菌感染。
　　 5.共表达猪链球菌2型SLY和MRP重组猪痘病毒的构建及其在CD1小鼠模型中的保护效率研究
　　 利用GFP基因作为筛选标记构建了一个用于获得表达外源基因的重组猪痘病毒的载体系统，并用这个系统得到了两个表达SS2保护性抗原的重组猪痘病毒rSPV-SLY和rSPV-SLY-MRP。通过肌肉注射，分别用rSPV-SLY、rSPV-SLY-MRP、SS2灭活疫苗（阳性对照）、SPV亲本病毒（阴性对照）及PBS（空白对照）给CD1小鼠免疫3次。在最后一次免疫后的第14天，用致死剂量或亚致死剂量的SS2强毒菌株ZY05719攻击CD1小鼠。分别在免疫的0、7、14、21、28、35、42及49天粟血用于测定小鼠的SLY和MRP特异性抗体水平。结果显示，重组病毒免疫组的特异性抗体在一免后的第7天就显著升高，且在加强免疫后持续上升。在免疫后的所有测定点，重组病毒免疫组的抗体滴度均显著高于阴性对照组（P＜0.001），也明显高于阳性对照组(P＜0.05)。数据还显示，重组病毒免疫组的小鼠各器官细菌含量显著低于阴性对照组（P＜0.05）;rSPV-SLY免疫组和rSPV-SLY-MRP免疫组的攻毒保护率分别70％和100％。这些数据表明，重组猪痘病毒rSPV-SLY和rSPV-SLY-MRP能显著保护CD1小鼠抵抗SS2强毒菌株的感染，可作为猪链球菌疫苗的候选物。
　　 6.共表达猪链球菌2型ECE、MRP和SLY重组猪痘病毒的构建及其在CD1小鼠模型中的保护效率研究
　　 利用猪痘病毒作为载体构建了三个表达SS2保护性抗原的重组病毒rSPV-ECE、rSPV-ECE-SLY和rSPV-ECE-MRP-SLY。经肌肉注射，分别用 rSPV-ECE、rSPV-ECE-SLY、rSPV-ECE-MRP-SLY、SS2灭活疫苗（阳性对照）、SPV亲本病毒（阴性对照）及PBS（空白对照）给CD1小鼠免疫3次。在最后一次免疫后的笫14天，用致死剂量或亚致死剂量的SS2强毒菌株ZY05719攻击CD1小鼠。分别在免疫的0、7、14、21、28、35、42及49天采血用于测定SS2保护性抗原的特异性抗体水平。结果显示，重组病毒免疫组的特异性抗体在一免后的第7天就显著升高，且在加强免疫后持续上升。在免疫后的所有测定点，重组病毒免疫组的抗体滴度均显著高于阴性对照组（P＜0.001），也明显高于阳性对照组(P＜0.05)。数据还显示，重组病毒免疫组的小鼠各器官细菌含量显著低于阴性对照组(P＜0.05);rSPV-ECE免疫组的攻毒保护率为60％，rSPV-ECE-SLY免疫组和rSPV-ECE-MRP-SLY免疫组的攻毒保护率均为100％。这些数据表明，表达SS2保护性抗原的重组猪痘病毒能显著保护CD1小鼠抵抗SS2强毒菌株的感染，可作为猪链球菌疫苗的候选物。

目录

声明

摘要

符号及缩略语

第一章 猪痘病毒及其作为载体的应用

1 SPV与猪痘

2 SPV的基因组

3 重组猪痘病毒的构建

4 SPV载体的应用

参考文献

第二章 猪链球菌2型保护性抗原的研究进展

1 概述

2 溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein，MRP)和胞外因子(Extracellular protein factor，EF)

3 溶血素(Suilysin，SLY)

4 内皮素转换酶(Endothelin-converting enzyme，ECE)

5 38-kDa蛋白

6 表面抗原1(Surface antigen one，Sao)

7 HP0197

8 烯醇酶(Enolase)

9 磷酸葡萄糖脱氢酶(6-phosphogluconate-dehydrogenase，6PGD)

10 菌毛亚单位

11 结语

参考文献

第三章 猪痘病毒的分离及猪痘的血清学调查

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 表达lacZ基因重组猪痘病毒的构建及其生物学特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第五章 表达绿色荧光蛋白的重组猪痘病毒的构建及其在鼠源细胞系中的复制和表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第六章 表达猪链球菌2型mrp基因片段的重组猪痘病毒的构建及免疫学评价

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

参考文献

第七章 共表达猪链球菌2型SLY和MRP重组猪痘病毒的构建及其在CD1小鼠模型中的保护效率研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第八章 共表达猪链球菌2型ECE、MRP和SLY重组猪痘病毒的构建及其在CD1小鼠模型中的保护效率研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢