两个棉花14-3-3蛋白相互作用蛋白质的筛选与鉴定

摘要

在以前的研究中，发现了两个棉花14-3-3蛋白质在野生型和棉花纤维发育突变体中差异表达。其中一个(EST为gi|78344446)在无絮棉突变体-3 DPA胚珠中上调表达，另一个(EST为gi|78324056)在徐州142陆地棉0 DPA胚珠中表达却在突变体0 DPA胚珠中不表达。表明14-3-3蛋白可能在纤维发育过程中起到调控作用。14-3-3蛋白是一类广泛存在于真核生物中高度保守的调控蛋白，主要通过与其它蛋白发生相互作用而发挥调控功能，因此探索14-3-3蛋白的功能应从研究与14-3-3蛋白互作的蛋白入手。
　　 本研究首先克隆了两个差异表达14-3-3蛋白质的编码基因全长，然后克隆到pET30原核表达载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，IPTG诱导表达后用Ni-NTA树脂纯化出带有六联组氨酸标签的14-3-3蛋白。从徐州142、徐州142无絮突变体、TM-1和李氏纤维有限伸长突变体的-3、-1、0 DPA胚珠和3、6 DPA纤维中提取总蛋白并等量混合。以该混合蛋白为猎物蛋白质源，以两个14-3-3蛋白质为诱饵，分别进行pull-down试验，获得棉花胚珠与纤维总蛋白中与14-3-3蛋白互作的蛋白，双向电泳分离后进行质谱分析，鉴定14-3-3相互作用蛋白质，为进一步研究14-3-3蛋白在纤维发育中的作用打下了基础。
　　 主要研究结果如下:
　　 1、根据EST序列（gi|78344446和gi|78324056），利用RACE技术，从陆地棉中克隆2个14-3-3蛋白编码基因全长，序列比对发现其中一个是新的棉花14-3-3蛋白家族基因，命名为Gh14-3-3-like protein2（GenBank登录号:JF320796），另一个序列与Gh14-3-3b（GenBank登录号:EU189221）仅相差三个氨基酸，可能是同一个蛋白。
　　 2、将两个14-3-3蛋白编码基因全长加上六联组氨酸标签并克隆至pET30原核表达载体上，IPTG诱导下，两个蛋白质均超量表达，SDS-PAGE电泳检测其分子量大约为30kD，与理论分子量一致。使用Ni-NTA镍柱纯化了这两个带6×His标签的14-3-3蛋白。
　　 3、分别以这两个蛋白质为诱饵，采用pull-down方法从-3、-1、0 DPA胚珠，3、6 DPA纤维提取的混合蛋白质中分离14-3-3的相互作用蛋白质。对分离的蛋白质进行双向电泳，MALDI-TOF-TOF串联质谱鉴定蛋白质点。发现了23个与Gh14-3-3-likeprotein2相互作用的蛋白，其中7个得到了鉴定，蛋白质功能涉及到胁迫反应、蛋白质代谢、核苷酸代谢，细胞骨架、跨膜运输、能量代谢、信号转导和其他功能。发现了29个与Gh14-3-3b发生相互作用的蛋白，其中16个得到了鉴定，这些蛋白质功能涉及到胁迫反应，蛋白运输定位、蛋白代谢、蛋白质构象、细胞骨架、14-3-3蛋白单体和其他功能。这些14-3-3互作蛋白的鉴定为深入解析14-3-3蛋白在棉花纤维初始发育的调控机理提供了线索。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 文献综述

第一章 棉纤维发育研究进展

1 起始分化期

2 伸长期／初生壁合成期

3 次生壁合成期

4 成熟期

第二章 蛋白质组学概论

1 蛋白质组学简介

2 蛋白质组学基本研究方法

3 植物蛋白质组学及其研究进展

4 蛋白质相互作用研究方法

第三章 14-3-3蛋白研究进展

1 14-3-3蛋白概述

2 14-3-3蛋白的结构

3 14-3-3蛋白定位

4 14-3-3蛋白主要功能

本研究的目的和意义

第二部分 研究报告

第四章 两个棉花14-3-3蛋白基因的克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与结论

第五章 两个Gh14-3-3的原核表达及纯化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与结论

第六章 Gh14-3-3 like protein 2互作蛋白的筛选与鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与结论

第七章 Gh14-3-3b互作蛋白的筛选与鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与结论

第三部分 全文结论

参考文献

附录

致谢