微卫星标记技术定性、定量鉴定动物源性成分的应用研究

摘要

商品中动物源成分的掺假、冒充、瞒报等关系食品安全的事件屡禁不止，损害着消费者的权益，影响着市场秩序。疯牛病的爆发，让人们开始重新思考饲料中添加动物源成分的可行性。因此，商品之中动物源成分的鉴定显得越来越重要。随着分子生物学技术的发展，微卫星DNA已被深入了解，微卫星DNA遵循孟德尔遗传定律，
　　 可以稳定遗传，被广泛应用于群体遗传研究，但是关于应用微卫星标记技术鉴别肉品的研究还鲜有报道。运用微卫星标记技术建立一种快速、有效的动物源成分的检测方法，确定动物成分的物种，能帮助质检人员提高工作效率降低成本，快速控制动物源性商品的随意流通，扩大食品安全控制范围，满足市场发展的检测需要。
　　 本试验应用微卫星标记技术鉴别商品中常见的动物源性成分。采集市场上常见的猪、牛、绵羊、山羊、鸭、鹅、鸡、狗为试验对象，从Gnenbank中初选出鸭、猪、牛、绵羊四种动物的微卫星标记，通过对微卫星标记的序列设计引物，然后进行PCR-凝胶电泳，筛选出每种动物具有种内通用、种间特异的微卫星标记用以鉴定。试验结果表明:在猪、牛、绵羊、山羊、鸭、鹅、鸡、狗的动物源性成分中鉴定鸭源性成分采用鸭的特异性微卫星标记AJ272583，扩增的目的片段为267bp;鉴定牛源性成分采用牛的特异性微卫星标记AB463，扩增的目的片段为178bp;鉴定绵羊源性成分采用牛的绵羊的特异性卫星标记x89268，扩增的目的片段为207bp;鉴定猪源性成分采用猪的特异性微卫星标记EF046，扩增的目的片段为212bp。
　　 分别应用鸭的微卫星标记AJ272583、牛的微卫星标记AB463、绵羊卫星标记x89268、猪的微卫星标记EF046进行荧光定量PCR，得到
　　 鸭源性成分肉的百分含量公式为C=10[(Ct-17.77)/-3.3844]×100％;
　　 牛源性成分肉的百分的含量的公式为C=10[(Ct-16.895)/-3.1275]×100％;
　　 绵羊源性成分肉的百分的含量的公式为C=10[(Ct-18.629)/-3.2525]×100％;
　　 猪源性成分肉的百分的含量的公式为C=10[(Ct-19.389)/-3.1439]×100％。
　　 实时荧光PCR法能够对混合肉品中鸭、牛、绵羊、猪源性成分进行快速准确地定性、定量分析，可以作为市场监督和检验鉴定的可行性方法。

目录

声明

摘要

文中所引部分缩略语

第一章 微卫星概述及研究现状

1 微卫星标记的概念

2 微卫星DNA的结构和作为分子遗传标记的优点

2．1 丰富性

2．2 多态性

2．3 保守性

2．4 呈共显性遗传而且遵循孟德尔遗传规律

2．5 容易检测，重复性好

3 微卫星产生及进化

3．1 滑链错配机制

3．2 减数分裂中不对等互换

4 微卫星标记的筛选

4．1 用经典分子生物学方法克隆所需要的微卫星位点

4．2 利用已发现的微卫星位点寻找新的位点

5 微卫星DNA的检测方法

5．1 变性聚丙烯酞胺凝胶电泳法

5．2 单链构象多态性(SSCP)

5．3 多重PCR微卫星荧光标记法

6 微卫星标记技术的应用

6．1 亲缘关系的比较和鉴定

6．2 疾病的诊断和鉴别

6．3 遗传图谱及QTL分析

6．4 种群研究及生物保种

第二章 肉品鉴定的研究进展

1 以显微镜观察为基础的检测方法

2 以检测蛋白质为基础的方法

3 以检测DNA为基础的方法

3．1 DNA杂交

3．2 DNA指纹分析

3．3 PCR-RFLP分析

3．4 PCR特异扩增(species-specific PCR)

4 层析色谱法

5 光谱学检测方法

第三章 实时定量PCR研究进展

1 FQ-PCR反应方法的分类

1．1 SYBR GreenⅠ

1．2 LC GreenTMⅠ荧光染料

1．3 水解探针(TaqMan)

1．4 分子信标

2 FQ-PCR方法的应用

2．1 病原体检测

2．2 肿瘤研究

2．3 基因表达研究

2．4 转基因研究

2．5 基因突变及多态性研究

参考文献

第四章 常见畜禽微卫星标记的筛选

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 鸭的特异性微卫星标记

2．2 牛的特异性微卫星标记

2．3 猪的特异性微卫星标记

2．4 绵羊的特异性微卫星标记

3 讨论

3．1 反应条件的优化

3．2 DNA提取

3．3 微卫星标记用于检测肉品的优点

3．4 微卫星标记的选取及其结果

4 小结

参考文献

第五章 混合肉品的定量鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 鸭源性成分的荧光定量PCR检测

2．2 鸭源性成分的曲线及计算公式

2．3 牛源性成分的荧光定量PCR检测

2．4 牛源性成分的曲线及计算公式

2．5 绵羊源性成分的荧光定量PCR检测

2．6 绵羊源性成分的曲线及计算公式

2．7 猪源性成分的荧光定量PCR检测

2．8 猪源性成分的曲线及计算公式

2．9 验证公式的合理性

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

论文创新点

致谢