运载OVA CD8+T细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及免疫原性研究

摘要

兔出血症(RabbitHemorrhagicDisease，RHD)是由兔出血症病毒(RabbitHemorrhagicDiseaseVirus，RHDV)引起的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、致死性和以全身实质器官出血为主要特征的传染病。RHDV是杯状病毒科成员，结构简单，仅有一个主要结构蛋白VP60，研究发现RHDV在兔体内可以诱导机体产生很强的体液免疫应答、细胞免疫应答和粘膜免疫应答，而且RHDV还有极强的诱导干扰素产生的能力。为了探究兔出血症病毒样颗粒（RHDV-VLPs）容纳外源抗原决定簇的能力，本文主要通过对RHDVVP60N端不同位点进行缺失和取代，研究VP60基因N端序列对RHDVVLPs影响，并以运载的OVA257-264CD8+T细胞(SIINFEKL)表位为参照，通过电镜观察和动物实验，研究VLPs组装所展示外源表位的长度、构象和抗原性，初步评价RHDVVLPs其作为外源表位展示系统的可行性并且为RHDV衣壳蛋白的形成机制和其它方面提供参考依据。
　　 主要的试验和结果如下:
　　 1.重组穿梭载体的构建通过SOE法对RHDVVP60基因序列的N端进行部分缺失或用CD8+T细胞表位(SIINFEKL)替换RHDV衣壳蛋白VP60的特定区域，将PCR扩增产物克隆入载体pMD19-Tvector，经酶切鉴定后、将目的片段连接至真核表达载体pFastBaeTM1，并对目的片段进行测序，获得的阳性重组质粒转化DH10Bac菌，经蓝白斑筛选及PCR鉴定后获得重组质粒，分别命名为N1、N2、I1、I2和D1。
　　 2.蛋白表达及鉴定将获得的阳性重组质粒转染Sf9细胞。逐日观察细胞，当出现明显的细胞病变时，收获病毒。提取细胞内总RNA进行RT-PCR扩增，阳性样品作为重组杆状病毒原液进行扩增和传代，并通过间接免疫荧光(IFA)、血凝试验(HA)、蛋白质电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)等试验鉴定蛋白的表达。RT-PCR结果显示5种重组杆状病毒在转染的细胞中发生转录;IFA结果显示5种重组杆状病毒在Sf9细胞内表达;SDS-PAGE电泳结果显示，5种嵌合蛋白均在Sf9细胞内表达，且大小约为60kDa;Western-blot结果显示，5种嵌合蛋白(N1、N2、I1、I2和D1)均能被RHDV单抗A3C特异性识别，证明5种嵌合蛋白的载体具有良好的反应原性;本试验中表达的5种嵌合蛋白，仅N1和N2有血凝性。
　　 3.嵌合蛋白的电镜观察和免疫原性对昆虫杆状病毒表达系统表达的5种嵌合蛋白进行电镜观察，初步纯化4种嵌合蛋白(N1、N2、I1、I2)免疫接种7～8周龄C57BL/6雌性小鼠，设RHDV-VLPs-VP60、无菌PBS为对照，共免疫三次，每次间隔两周，分别在二免及三免后两周摘眼球取血，脱颈处死小鼠，无菌取脾。间接ELISA测定0d、28d、42d血清中VP60抗体水平;分离淋巴细胞，ELISPOT检测特异性分泌IFN-γ水平。结果显示:5种嵌合蛋白中，N1、N2可形成完整的VLPs，大小约为40nm，形态与天然兔出血症病毒样粒子类似;I1、I2形成的病毒样粒子较小约30nm;D1形成VLPs数量很少，几乎不可见。4种嵌合蛋白(N1、N2、I1、I2)通过腹腔注射途径免疫均可诱导小鼠产生抗载体VP60的体液免疫应答和针对外源T细胞表位的细胞免疫应答，其中I1、I2所引发的针对载体特异性抗体水平和细胞免疫应答水平均较高，而N1、N2较低。可初步推测，VP60第196～229位aa区域可能是N端携带外源T细胞表位的较优区域。
　　 本文构建整合CD8+T细胞表位的嵌合蛋白。该T细胞表位来自鸡源卵清蛋白OVA257-264(SIINFEKL)，受MHCⅠ类分子限制。T细胞表位分别嵌合在RHDVVLP的不同位置:1）直接插入VP60的N末端(N1);2)取代VP60N端2～13位氨基酸残基(N2);3)缺失、取代VP60N端196～207位氨基酸残基（D1和I1）;4）取代VP60N端217～228位氨基酸残基(I2)。嵌合RHDV病毒样粒子作为疫苗载体的研究结果表明，RHDV-VLPs-OVA不同程度的诱发特异性抗VP60的体液免疫应答和特异性IFN-γ分泌。本研究为以RHDVVLPs为载体的多价疫苗研究提供理论依据，为后期评价RHDVVLPs展示系统奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

1 兔出血症病毒RHDV的介绍

1．1 兔出血症病毒RHDV的分类

1．2 RHDV的分子生物学研究进展

1．3 RHDV的生物学特性

2 病毒样颗粒

2．1 病毒样颗粒的特点

2．2 VLPs在疫苗中的应用

2．3 VP60 VLPs研究进展

参考文献

第一章 5种VP60重组穿梭载体的构建

1 材料与方法

2 实验结果

2．1 PCR扩增目的片段

2．2 T/A克隆质粒的鉴定

2．3 重组表达载体的酶切鉴定

2．4 重组Bacmid鉴定

3 讨论

3．1 SOE法构建嵌合基因

3．2 插入外源表位的位置

参考文献

第二章 5种嵌合蛋白的表达及检测

1 材料与方法

1 结果

2．1 转染

2．2 RT-PCR鉴定重组病毒的mRNA

2．3 重组蛋白的表达及免疫印迹鉴定

2．8 血凝实验

2．9 免疫荧光

3 讨论

3．1 表达系统的选择

3．2 关于嵌合蛋白的血凝特性

参考文献

第三章 嵌合蛋白的电镜观察和免疫原性

1 材料与方法

2 结果

2．1 电镜观察

2．2 载体的ELISA抗体水平

2．3 ELISPOT检测特异性IFN-γ分泌

3 讨论

3．1 电镜

3．2 动物实验

参考文献

全文总结

附录

致谢