北冬虫夏草主要有效成分的含量测定研究

摘要

北虫草[Cordyceps militaris(L.ex Fr.) Link]是我国一种重要药用真菌，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖和保肝等药理作用，用于肺结核、老人虚弱和贫血等疾病的治疗。目前衡量北虫草质量的重要指标是有效成分甘露醇、虫草多糖和虫草核苷的含量测定，目前这三种主要有效成分的测定方法很多，测定结果也有较大差异。本论文运用高效阴离子色谱、高效液相等先进手段，研究北虫草中甘露醇、虫草多糖和虫草核苷的含量测定，并与目前经常使用的方法进行比较，为北虫草中有效成分的准确测定建立科学依据。
　　 目前甘露醇最常用的测定方法是比色法，其最大的缺点在于无法去除类似糖醇的干扰。本实验运用HPLC法和高效离子色谱法两种方法对北虫草中甘露醇进行测定，并与比色法进行比较。HPLC法和高效离子色谱法这两个方法都能将甘露醇与其它单糖或糖醇有效分离，方法学研究发现，这两种方法重复性好、精密度高和重现性好，且加样回收率在95-105％之间，适合于北虫草中甘露醇的测定。对三种方法测定北虫草中甘露醇含量进行比较，发现HPLC法和高效离子色谱法测定值间无显著差异，而比色法测得值明显高于HPLC法及离子色谱法，并有显著性差异。因此，高效液相法和高效阴离子色谱法都能将北虫草中干扰物质有效分离，是准确测定北虫草中甘露醇的含量的方法。
　　 北虫草多糖的含量测定基本方法为苯酚-浓硫酸法，由于不同文献中虫草多糖的测定结果相差非常大。为准确测定北虫草中甘露醇含量，本试验运用高效阴离子法测定干扰物质，比较水提醇沉和醇提水提两种多糖前处理后的测定液中干扰物质的含量，以及对多糖含量测定的影响，建立准确的多糖测定方法。结果发现水提醇沉法前处理后，提取液中干扰物质仍超过10％，而且步骤多，重复性差。而醇提水提法简便、快速、精确，处理后的提取液干扰物质低于1％，适用于北虫草中多糖测定的前处理。同时对提取方法进行优化，测定的最佳方法为，先用80％乙醇提取2次，提取温度100°，提取时间3小时，液料比1∶100，此方法稳定，重复性好，适合北虫草中多糖含量测定。
　　 核苷类成分是北虫草中主要活性成分，通过核苷类指纹图谱发现，除已知核苷类成分虫草素、腺苷外，还有一个含量较高的未知峰。为明确指纹图谱中未知峰化学成分，运用NKA-Ⅱ大孔吸附树脂和C-18分离纯化得到了未知峰的结晶，通过1HNMR，13CNMR、质谱等波谱分析，并文献报道数据进行比对，鉴定出化合物为N6-（2-羟乙基）-腺苷。运用高效液相法，建立了虫草素、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷的测定方法。最优提取条件为超声30min，液料比1∶50。用YMC AQ-C18分析柱，甲醇水梯度洗脱。方法学考察结果表明，该方法准确度高，稳定性、精密度、重现性好，对N6-(2-羟乙基)腺苷标准品的检测特异性良好，适用于北虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷含量的分析。同时细胞活性实验发现该化合物对K562肿瘤细胞具有抑制作用，半数抑制有效浓度为0.1μmol/mL。

目录

声明

摘要

符号与缩略语

第一章 文献综述

1 虫草酸含量测定的研究

1．1 虫草酸(甘露醇)的化学特性、分布和药理活性的研究

1．2 虫草中甘露醇含量测定方法的研究

2 虫草多糖含量测定的研究

2．1 北虫草多糖的生物活性研究

2．2 北虫草多糖的分离纯化和结构研究

2．3 虫草多糖的含量测定研究

3 核苷类化合物含量测定的研究

3．1 核苷类化合物的生物活性研究

3．2 核苷类指纹图谱的研究

3．3 北虫草核苷类物质的含量测定研究

4 本研究的目的意义及主要内容

4．1 研究北虫草主要有效成分的含量测定的目的意义

4．2 主要研究内容

第二章 北虫草中甘露醇的含量测定的研究

1 材料

1．1 仪器

1．2 材料

1．3 试剂

2 实验方法

2．1 HPLC法

2．2 高效阴离子法

2．3 比色法测定北虫草中甘露醇的含量

3 结果和分析

3．1 HPLC测定北虫草中甘露醇的含量测定方法的建立

3．2 高效阴离子法测定北虫草中甘露醇的含量

3．3 甘露醇测定方法的比较

4 本章小结

第三章 北虫草中多糖的含量测定的研究

1 材料

1．1 仪器

1．2 材料

1．3 试剂

2 实验方法

2．1 北虫草多糖中干扰物质的检测

2．2 虫草多糖的测定方法

2．3 水提醇沉处理法对北虫草多糖测定的影响

2．4 醇提水提处理法对北虫草多糖测定的影响

2．5 北虫草多糖测定的方法学考察

2．6 不同来源北虫草多糖的含量测定

3 实验结果

3．1 北虫草水提取物中单糖、糖醇和寡糖类物质的检测

3．2 甘露醇、海藻糖对北虫草多糖测定的干扰

3．3 HPLC法检测干扰物质海藻糖含量

3．4 水提醇沉法对北虫草多糖测定的影响

3．5 醇提水提法对北虫草多糖测定的影响

3．6 方法学考察

3．7 北虫草多糖的含量测定

4 本章小结

第四章 北虫草中核苷类化合物含量测定的研究

1 材料

1．1 仪器

1．2 材料

1．3 试剂

2 实验方法

2．1 未知峰的分离纯化

2．2 HPLC色谱条件优化

2．3 样品前处理方法优化

2．4 方法学考察

2．5 N6-(2-羟乙基)腺苷活性研究

3 实验结果

3．1 北虫草核苷类化合物HPLC的指纹图谱

3．2 未知峰的分离纯化

3．3 未知化合物的结构鉴定

3．4 核苷类化合物的含量测定研究

3．5 N6-(2-羟乙基)腺苷活性研究

4 本章小结

第五章 讨论和全文总结

1 讨论

1．1 北虫草中甘露醇含量测定方法的比较

1．2 北虫草中多糖含量测定方法比较

1．3 北虫草中核苷类物质含量测定的研究

2 全文总结

2．1 北虫草中甘露醇含量测定的研究

2．2 北虫草中多糖含量测定的研究

2．3 北虫草中腺苷类化合物含量测定的研究

3 创新点

4 展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文