菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E基因的克隆、表达分析及其与菊花B病毒外壳蛋白的互作研究

摘要

菊花(Chrysanthemum xmorifolium)为菊科菊属多年生宿根草本植物，具有很高的观赏和经济价值。菊花栽培品种生产上主要依靠扦插繁殖，非常有利于病毒病的积累和传播，极大地降低了菊花的品质和经济价值。国内外已报道的能够侵染菊花的病毒有20多种，我国已报道的有8种，其中菊花B病毒(Chrysanthemum B Virus，CVB)已成为侵染危害菊花的优势病毒。研究发现，真核翻译起始因子4E(eukaryotictranslation initiation factor4E，eIF4E)是翻译起始因子eIF4F的一个亚单位，是mRNA翻译中最有效的限速调节因子。eIF4E除了在植物的基因表达调控中起重要作用，eIF4E还是RNA病毒增殖不可缺少的敏感性因子，在植物病毒侵染过程中起关键作用。所以，通过分子生物学的手段突变eIF4E能影响病毒-植物的互作，从而有效的阻断病毒的侵染，而且利用植物自身基因所获得的抗性具有一定的广谱性。菊花中翻译起始因子4E基因的研究还未见报道，因此，本研究以CVB和菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E为研究对象，针对其致病机制以及植物所对应的抗病性开展研究。本文从菊花中分离克隆出菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E基因，分析其表达特性，并研究了其与CVB CP的互作关系。为翻译起始因子4E在植物自身表达调控及其病毒侵染等方面的研究提供一定的理论基础。主要研究结果如下:
　　 1.同源克隆法克隆到菊花eIF4E、eIF(iso)4E基因的cDNA全长序列，分别命名为CmeIF4E(Genbank登录号为JQ904591)和CmeIF(iso)4E(Genbank登录号为JQ904592)。序列分析显示，这2个基因均具有两个IF4E家族结构域，为典型的翻译起始因子4E基因。CmeIF4E基因全长914 bp，654 bp ORF编码218个氨基酸，推导的氨基酸序列与莴苣同源性最高为79％，其中，在蛋白质翻译起始过程中与eIF4G和mRNA帽子结构结合的位点，具有高度的保守性。CmeIF(iso)4E基因全长818 bp，573bp ORF编码191个氨基酸，推导的氨基酸序列与莴苣同源性为90％。CmeIF4E和CmeIF(iso)4E两者氨基酸序列相似度为45.66％。
　　 2.荧光定量PCR结果表明，CmeIF4E和CmeIF(iso)4E基因在切花菊‘神马’的根、茎、叶、管状花、舌状花都有表达，CmeIF4E的转录由高到低依次是根、叶、管状花、茎、舌状花，CmeIF(iso)4E的表达水平由高到低依次是根、管状花、舌状花、叶、茎。
　　 3.构建绿色荧光蛋白融合表达载体，基因枪法转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达，结果表明，菊花CmeIF4E和CmeIF(iso)4E蛋白在细胞核，细胞质，细胞膜都有分布。
　　 4.构建酵母表达载体pGBKT7-CVBCP以及pGADT7-CmeIF4E和pGADT7-CmeIF(iso)4E，利用酵母双杂交系统证明了CmeIF(iso)4E与CVBCP存在蛋白间的互作;进一步采用双分子荧光互补技术验证CmeIF(iso)4E与CVBCP蛋白的互作，结果表明，CmeIF(iso)4E与CVBCP在细胞核、细胞质、细胞膜均有互作。
　　 5.采用酵母双杂交系统筛选切花菊‘神马’文库中与菊花B病毒外壳蛋白以及CmeIF4E、CmeIF(iso)4E互作的蛋白。初步得到了与CVB外壳蛋白相互作用的E3泛素连接酶ARIADNE-like蛋白和ATP结合蛋白。筛选得到与CmeIF4E及其异构体CmeIF(iso)4E互作蛋白主要包括蛋白质合成、光合作用、抗逆和防御等相关蛋白。如翻译起始因子4A、核糖体失活蛋白、核酮糖-1，5-二磷酸酶等。

目录

声明

摘要

缩略词(Abbreviations)

引言

第一章 文献综述

1 植物病害及其症状研究

1．1 植物病毒介绍及其引起的症状

1．2 菊花病毒病害

2 植物的抗病毒机制

2．1 显性抗性基因

2．2 隐性抗性基因

3 抗病毒基因工程的研究进展

4 植物eIF4E的研究进展

5 蛋白互作研究方法

5．1 酵母双杂交

5．2 双分子荧光互补技术

6 本研究的目的和意义

第二章 菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E基因的克隆及序列分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 菌株、质粒、试剂以及仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 RNA提取与反转录检测

2．2 CmeIF4E和CmeIF(iso)4E基因的克隆

2．3 CmeIF4E和CmeIF(iso)4E基因的序列分析

3 讨论

第三章 菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E基因的表达特性及定位分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 试剂与仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 CmeIF4E和CmeIF(iso)4E基因在不同器官表达分析

2．2 CmeIF4E和CmeIF(iso)4E的亚细胞定位分析

3 讨论

第四章 菊花CmeIF4E、CmeIF(iso)4E与菊花B病毒外壳蛋白的互作研究

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 菌株、质粒、试剂以及仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 酵母双杂交系统验证CmeIF4E、CmeIF(iso)4E和CVBCP蛋白互作关系

2．2 BiFC技术分析CmeIF4E和CVB CP蛋白互作关系

3 讨论

第五章 酵母双杂交系统筛选菊花中CmeIF4E、CmeIF(iso)4E及CVBCP的互作蛋白

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 菌株、质粒、试剂以及仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 CmeIF4E、CmeIF(iso)4E蛋白诱饵表达载体的构建

2．2 重组质粒的酵母转化及毒性检测

2．3 诱饵蛋白的自激活活性检测

2．4 酵母交配转化及筛选阳性克隆的筛选

3 讨论

全文结论

创新点

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文