菊花‘神马’花芽分化期的数字基因表达谱及关键基因的克隆和表达分析

摘要

菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是菊科(Asteraceae)菊属(Chrysanthemum)植物，是世界四大鲜切花之一。栽培品种3000多个，用于切花菊的品种多为典型的短日照植物，光周期途径调控开花主要由光受体基因接受光信号，传递给节律钟基因，通过节律钟调控输出基因激活下游转录因子的表达，在叶中上调促进开花基因的表达，输送到茎尖与成花整合因子作用完成花芽分化。
　　 本研究以白色切花菊‘神马’为试材，因其典型的短日照特点，能较准确人工调控花芽分化进程，是研究菊花花芽分化分子机理的模式材料。通过大规模高通量测序，获得数据与NCBI核酸蛋白数据库进行比对，经生物信息分析，确定功能分类及涉及的代谢途径，获得菊花花芽分化期相关的基因表达信息，探索在菊花不同花芽分化阶段相关基因的差异表达富集模式及表达谱;对光周期途径的关键基因进行全长的克隆与表达分析，在分子水平上对菊花开花时间的网络途径有初步的了解，为后期进一步进行基因的功能验证及通过分子育种方法（反义抑制或转基因）培育目标花期新品种提供基础理论依据。
　　 本研究主要成果如下:
　　 1.本试验获得菊花花芽分化期转录组ESTs，对所有unigenes进行功能分类，收集到54，488条分属于分子功能、细胞组分和生物学过程的unigenes。其中参与分子功能的共12种，参与细胞组分的共11种，参与生物学过程的共18种。得到编码蛋白框(CDS)的核酸序列和氨基酸序列为54，644条。用ESTscan比对所有unigenes，得到其CDS的核酸序列和氨基酸序列均为8，506条。将所有unigenes与COG数据库BLAST比对显示，共获得22，871条与已知其他植物同源，属于23类直系同源簇群，未知功能的有780条;得到25，001条参与代谢通路的unigenes，从中收集到与植物节律代谢通路相关unigenes共269条，从中比对到参与光周期途径的光受体基因、生物节律钟基因和生物节律钟输入和输出基因等相似功能基因共20个。
　　 2.初步得出菊花花芽分化期涉及植物节律途径的数字基因表达谱:
　　 菊花光受体HYB在花芽分化启动期表达量达最高值，是暗处理前的近五倍，随后稍有下降，到总苞鳞片分化中期仍维持暗处理前的近三倍，到分化完成一直还维持近两倍的表达量;
　　 节律钟组件APRS、TOC1表达高峰值均出现在总苞鳞片分化中期;PIF3高峰值出现在花芽分化启动期，到总苞鳞片分化中期仍维持暗处理前的近三倍;FKF1在花芽分化启动期上调到高峰值，总苞鳞片分化中期下调表达，随后在小花原基分化中期和分化完成期又上调到高峰。
　　 节律钟输出基因GI在花芽分化启动期表达量达最高值，在总苞鳞片分化中期稍有下降，分化完成期又有回升。
　　 CO暗处理一天后反而表达量降低，在总苞鳞片分化中期表达量达最高值。
　　 CHS（查尔酮合成酶）在暗处理一天后表达量上调，启动期达近五倍的最高值，总苞鳞片分化中期表达量稍下降，随后在小花原基分化中期下调表达。
　　 3.初步得出菊花花芽分化期差异表达基因显著富集的最主要生化代谢途径和信号转导途径:集中在光合作用及核蛋白体途径中。
　　 4.初步得出菊花不同花芽分化阶段差异表达基因富集参与的生物功能:
　　 花芽未分化期，植物中蛋白质精氨酸甲基转移酶家族基因和蛋白参与基因转录调控、氧化还原酶活性基因转录加强;花芽分化启动期，脂肪酸合成酶、糖氢共转运蛋白活性基因差异表达富集，蛋白质精氨酸甲基转移酶的差异表达显著;总苞鳞片分化中期，信息显示富集在各种蛋白质、核苷酸糖的合成;小花原基分化中期，蛋白质精氨酸甲基转移酶活性加强，氧化还原酶活性基因转录加强;花冠分化末期即花芽分化完成期，基因差异表达富集仍在结构分子活动、砷酸盐还原酶活性和作为花和花粉发育的能量来源的脯氨酸的累积等方面。
　　 5.从菊花‘神马’中克隆得到节律钟输出基因GIGANTEA的cDNA全长序列，命名为CmGI基因，登录号为JQ043439。对其做序列信息分析;菊花CmGI的表达呈昼夜节律表达模式，高峰值出现在16:00;不同花芽分化阶段叶片中CmGI基因mRNA水平差异大，两个高峰值分别出现在花芽分化启动期和小花原基分化中期;盛花期表达量较高。
　　 6.从菊花‘神马’中克隆得到开花相关基因CmCOL的cDNA全长序列，登录号为KC589293，对其做序列信息分析;菊花CmCOL mRNA在叶中高表达，呈昼夜节律表达模式，表达高峰值出现在04:00;短日照处理能上调叶中CmCOL，对芽中的影响不明显;不同花芽分化阶段叶片中高峰值出现在小花原基分化中期;盛花期叶片中高表达。
　　 7.菊花CmFTL mRNA只在短日照条件下的叶片中呈现节律表达，00:00时为高峰值;芽中及长日照叶、芽中均检测不到昼夜起伏;不同花芽分化阶段叶片中CmFTLmRNA水平差异大，小花原基分化中期达最高峰值;花蕾期叶中高表达。
　　 8.研究显示菊花叶片感应光周期，短日照条件下CmGI首先于暗处理1d后启动上调，花芽分化启动期出现第一个峰值，而CmCOL则滞后CmGI,于花芽分化启动期轻微上调，暗示CmGI位于CmCOL上游，小花原基分化中期CmGI上调至高峰值时CmCOL上调到高峰。CmFTL在CmCOL微调时则无明显变化，在小花原基分化中期CmCOL上调至高峰值时CmFTL也上调到高峰值，暗示CmFTL滞后CmCOL，位于其下游。
　　 实验揭示菊花CmGI、CmCOL、CmFTL在SD条件下与拟南芥LD下及水稻SD下的GI-CO-FT调控模式相似。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 植物花芽分化研究的现状和发展趋势

1．1．1 植物调控花芽分化的途径

1．1．2 光周期途径中涉及的光受体基因

1．1．3 光周期途径中涉及的生物节律钟基因

1．1．4 光周期途径中涉及的节律钟下游基因

1．1．5 菊花与光周期途径相关基因的研究

1．2 研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 植物材料和处理

2．1．1 植物材料和试验处理

2．1．2 主要试剂及仪器

2．1．3 数据分析用软件

2．2 采取的研究方案及技术路线

2．2．1 研究方案

2．2．2 技术路线

2．3 菊花花芽分化期转录组cDNA文库的构建及测序分析

2．3．1 菊花总RNA的提取

2．3．2 转录组cDNA固相文库的构建和测序

2．3．3 转录组Unigenes信息分析

2．4 菊花花芽分化期数字基因表达谱测序及信息分析

2．4．1 数字基因表达谱文库的构建和测序

2．4．2 数字基因表达谱文库测序信息分析

2．5 菊花光周期途径关键基因的克隆

2．5．1 应用RT-PCR、RACE技术克隆关键基因cDNA全长序列

2．5．2 关键基因的cDNA全长序列分析

2．5．3 关键基因的实时荧光定量分析

3 结果与分析

3．1 菊花花芽分化期转录组unigenes分析

3．1．1 菊花花芽分化期unigenes的获取

3．1．2 菊花花芽分化期unigenes的GO功能分类注释

3．1．3 菊花花芽分化期unigenes涉及的代谢通路分析

3．1．4 菊花花芽分化期涉及植物节律代谢途径的unigenes分析

3．1．5 菊花花芽分化期unigenes的编码蛋白(CDS)分析

3．1．6 菊花花芽分化期unigene的COG注释功能

3．2 菊花花芽分化期的数字基因表达谱分析

3．2．1 数字基因表达谱数据评价分析

3．2．2 六个文库部分差异表达基因等级聚类分析

3．2．3 六个文库差异表达基因统计分析

3．2．4 六个文库涉及植物节律通路的部分tags分析

3．2．5 六个文库差异表达基因Pathway显著性富集分析

3．2．6 六个文库差异表达基因Gene Ontology功能显著性富集分析

3．3 菊花节律钟输出基因CmGI(GIGANTEA)的克隆及序列信息和定量表达分析

3．3．1 CmGI基因cDNA全长克隆

3．3．2 CmGI蛋白质序列分析

3．3．3 CmGI蛋白质基本性质分析

3．3．4 CmGI蛋白质二级结构分析

3．3．5 CmGI蛋白质三级结构分析

3．3．6 CmGI的mRNA相对定量表达分析

3．4 菊花开花相关基因CmCOL(CONSTANS-Like)的克隆及序列信息分析

3．4．1 CmCOL基因cDNA全长克隆

3．4．2 CmCOL序列信息分析

3．4．3 CmCOL蛋白质基本性质分析

3．4．4 CmCOL蛋白质的二级结构

3．4．5 CmCOL蛋白质的三级结构

3．5 CmCOL、CmFTL mRNA相对定量表达分析

3．5．1 引物设计和扩增特异性的分析

3．5．2 CmCOL mRNA昼夜相对定量表达分析

3．5．3 CmCOL mRNA在花芽分化不同阶段的相对定量表达分析

3．5．4 CmCOL mRNA在组培苗、花蕾期、盛花期的相对定量表达分析

3．5．5 CmFTL mRNA昼夜相对定量表达分析

3．5．6 CmFTL mRNA在花芽分化不同阶段的相对定量表达分析

3．5．7 CmFTL mRNA在组培苗、花蕾期、盛花期的相对定量表达分析

3．6 CmGI、CmCOL、CmFTL mRNA相对定量表达比较分析

4 讨论

4．1 菊花花芽分化期转录组信息

4．1．1 EST法筛选菊花花芽分化期unigenes

4．1．2 菊花花芽分化期Unigenes的GO功能分类

4．1．3 菊花花芽分化期Unigene的KEGG代谢途径注释

4．1．4 转录组序列信息的应用

4．2 菊花花芽分化期数字表达谱信息

4．2．1 涉及植物节律钟通路的tags分析

4．2．2 六个文库主要富集Pathway分析

4．2．3 花芽未分化期差异表达基因功能显著性富集分析

4．2．4 花芽分化启动期差异表达基因功能显著性富集分析

4．2．5 总苞鳞片分化中期差异表达基因功能显著性富集分析

4．2．6 小花原基分化中期差异表达基因功能显著性富集分析

4．2．7 花冠分化末期即花芽分化完成期差异表达基因功能显著性富集分析

4．2．8 数字基因表达谱信息的应用

4．3 菊花CraGI、CmCOL、CmFTL基因对光周期响应的关联性

5 结论

5．1 菊花花芽分化期转录组unigenes GO功能分类

5．2 菊花花芽分化期转录组unigenes涉及的代谢途径

5．3 菊花花芽分化期涉及植物节律途径的数字基因表达谱

5．4 菊花花芽分化期差异表达基因显著富集的代谢途径

5．5 菊花花芽分化期不同阶段差异表达基因富集参与的生物功能

5．6 菊花节律钟输出基因CmCI序列信息及表达特征

5．7 菊花开花相关基因CmCOL序列信息及表达特征

5．8 菊花CmFTL基因的表达特征

5．9 菊花CmGI、CmCOL、CmFTL基因的关联性表达特征

参考文献

7 附录

致谢

9 攻读学位期间发表论文情况