山东省部分地区猪瘟流行病学调查及其E2基因的毕赤酵母表达

摘要

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的一种热性、全身性出血、败血性传染病，以很强的传染性和高致死率为特征，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，给养猪业造成了巨大的经济损失。近年来猪瘟免疫失败的报道较多，猪瘟流行出现了一些新特点，这可能与高免疫压力下猪瘟病毒变异存在一定的相关性，因此，开展猪瘟流行病学调查，掌握猪瘟的流行状况及病毒的变异程度，以及研发亚单位疫苗作为根除猪瘟的技术储备，对猪瘟的防控具有极其重要的意义。
　　 本研究首先利用IDEXX公司的猪瘟抗体、抗原检测试剂盒对2011年来自山东省不同地区的10个规模化免疫猪场的猪群做了抗体水平、抗原感染检测，其中对此10个猪场共1028份血清进行了抗体水平检测，另对这10个猪场中免疫状况较差的5个猪场重新采取的383份血清进行了抗原检测，结果抗体阳性率为45.34％-84.00％不等，抗原阳性率为0％-2.32％不等，说明所监测的山东部分地区猪瘟免疫水平参差不齐，部分猪场免疫效果较差，达不到良好的保护率，同时发现免疫猪群存在猪瘟带毒现象。
　　 针对猪瘟带毒、免疫失败现象，我们又对上述所检测猪场中送检来的13份病料进行了RT-PCR检测，共鉴定出6份猪瘟阳性病料，将之接种于PK-15细胞，成功分离到6株猪瘟病毒，分别命名为HZ、LW、YT、JN、RZ、TA，对这六株猪瘟毒株进行实时荧光定量检测，结果表明它们均是流行野毒株，从而进一步证实了免疫猪场的确存在猪瘟带毒现象，因此在实际生产中，应对猪群的猪瘟抗体水平进行定期监测，并适时采取措施，使之保持在较好的水平之上，以抵抗野毒的感染。
　　 利用分子生物学技术，我们对已分离的6株猪瘟毒株进行E2基因部分编码序列的扩增、克隆并测序，利用DNAstar软件对测序结果和推断的蛋白序列与Shimen株、HCLV株，Alfort株等9株经典猪瘟毒株连行比对，结果发现分离毒株E2基因之间的无论核苷酸同源性还是蛋白质同源性都很高;而与经典毒株比较，核苷酸同源性在79.4％-94.8％不等，蛋白质同源性在82.6％-96.1％不等，其中与GuangXi株的同源性最高;与HCLV株的核苷酸序列、蛋白质序列同源性分别只为79.4％-82.3％和83.2％-88.0％，与Shimen株的核苷酸序列、蛋白序列同源性只为81.3％-84.3％和84.4％-89.2％，这意味着山东省最近一年流行的猪瘟毒株与广西株有一定的亲缘关系，而与我国的疫苗株和Shimen株相比，则发生了较大的变异，说明我国猪瘟流行毒株正朝着远离疫苗毒株的方向变化;根据遗传进化树分析，此6株山东省流行猪瘟毒株均属于基因Ⅱ群，与GuangXi株同属于一个基因群，且都属于2.2亚基因群，而Shimen株、HCLV株属于基因Ⅰ群。
　　 鉴于山东省最近一年的流行毒株已向远离疫苗株的方向变化，这种变化是否是猪瘟免疫失败的原因之一尚难确定，但是开展猪瘟根除和猪瘟净化技术储备的研究，尤其是开展猪瘟基因工程疫苗的研究，意义还是非常重大的。我们对猪瘟病毒最主要的保护性抗原E2基因进行了去除跨膜区域的PCR扩增，将其插入巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建重组质粒pPICZαA-E2，将该质粒用SacⅠ酶切线性化后，电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X-33中，经Zeocin筛选得到高拷贝转化子，通过甲醇诱导表达，SDS-PAGE和Western bolt试验验证，结果表明E2蛋白在酵母中获得成功表达，为猪瘟基因工程亚单位疫苗研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一篇 文献综述

第一章 猪瘟概述

1 猪瘟流行病学

2 猪瘟临床及病理表现

3 猪瘟的诊断

4 猪瘟疫苗的研究进展

参考文献

第二章 猪瘟病毒的概述

1 病毒的基本生物学特性

2 病毒的分子生物学特征

参考文献

第三章 毕赤酵母表达系统概述

1 酵母表达系统的发展

2 毕赤酵母表达系统的特点

3 毕赤酵母表达的缺陷及应用前景

参考文献

第二篇 研究内容

第一章 山东省部分规模化猪场猪瘟监测与分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 分析和讨论

参考文献

第二章 猪瘟病毒的分离鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 分析和讨论

参考文献

第三章 猪瘟分离株E2基因序列的克隆与变异性分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论和分析

参考文献

第四章 猪瘟E2基因的毕赤酵母表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论与分析

参考文献

全文总结

附录

致谢