马链球菌兽疫亚种感染相关因子的筛选、鉴定及分析

摘要

马链球菌兽疫亚种（Streptococcusequissp.zooepidemicus，SEZ）是兰氏分群中的C群β溶血链球菌，可以感染人及多种动物。近年来，兽疫亚种已成为我国猪链球菌病的主要病原，能导致猪的败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及猪的突发性死亡。这不仅严重威胁着养猪业从业人员的健康，还制约了规模化养猪业的发展。目前，马链球菌兽疫亚种的全基因组测序工作已经完成，新毒力基因的相关研究亟待发展。本试验以SEZ的强毒株ATCC35246为研究对象，运用体内诱导抗原技术（invivo-inducedantigentechnology，IVIAT）对其进行了体内诱导基因（invivo-inducedgene，ivigene）的筛选。不仅为全面认识SEZ感染相关因子在感染动物机体的过程中的作用奠定了基础，还有助于病原菌的致病机制的研究，同时也能够为抗菌药物、诊断试剂及疫苗设计等研究提供潜在靶标。
　　 1、表达文库的构建
　　 根据NCBI公布的马链球菌兽疫亚种ATCC35246的全基因组序列，选择几种可能的限制性内切酶用DNAStar对其进行模拟酶切，再结合凝胶电泳模拟图根据所需要的片段范围确定合适的内切酶，然后培养实验室保存的模式株ATCC35246提取基因组，经酶切条件优化后选择最适的酶切温度、时间及酶量，然后进行大量酶切，回收并纯化大小合适的基因组酶切片断，与单酶切并去磷酸化的表达载体系列(pET28abc)连接，电转化进大肠杆菌DH5α，并用载体特异性引物分析插入率及插入的片段大小。最后，提取质粒电转化至表达宿主菌BL21(DE3)构建出相应的表达文库。
　　 2、制备筛选用血清库
　　 采集耐过ATCC35246的猪血清及SPF猪血清，将得到的数份血清混合，分别与SEZ及大肠杆菌体外表达的抗原结合以除去体外培养时表达的蛋白、表达质粒的宿主菌菌体蛋白及空质粒可能表达的蛋白，然后用间接ELISA方法检测每一步的吸附效果，从而制备出用于免疫筛选的血清库。
　　 3基因组表达文库的免疫筛选
　　 对上述建立的表达文库进行诱导表达，然后转移至硝酸纤维素膜上裂解并释放表达的蛋白，接着用构建的血清库对该基因组表达文库进行免疫筛选，通过三轮免疫筛选及PCR检测最终得到42个阳性克隆。将这些阳性克隆送公司，通过NCBI对测序结果进行BLAST分析，结果显示其中有39个克隆的基因片段与马链球菌兽疫亚种ATCC35246株的基因组序列完全吻合。通过软件查找到这些片段所编码的蛋白，这些蛋白涉及能量代谢、分子合成、调节、转运等功能，还有膜蛋白和未知功能蛋白。而且其中绝大多数毒力基因的序列与马链球菌兽疫亚种H70、MGCS10565及马链球菌马亚种4047有很高的同源性。
　　 总之，本研究应用IVIAT技术筛选到了一些马链球菌兽疫亚种侵入猪体后才诱导表达或上调表达的基因，并对基因的功能做了初步的探讨，为猪链球菌病的预防和治疗分子靶位的研究提供了有价值的资料。

目录

声明

摘要

第一章 马链球菌兽疫亚种的研究进展

1 病原学

2 流行病学

3 临床症状及病理变化

4 毒力因子

4．1 类M蛋白

4．2 纤维结合素结合蛋白

4．3 IgG结合蛋白

4．4 金属结合脂蛋白

4．5 链激酶

4．6 透明质酸荚膜

5 细菌体内表达毒力基因的分析与鉴定

5．1 抑制性差减杂交(Suppression subtractive hybridization，SSH)

5．2 mRNA差异显示技术(mRNA differential display)

5．3 体内表达技术(in vivo expression technolgy，IVET)

5．4 信号标签变异(signature-tagged mutagenesis，STM)

5．5 差示荧光诱导法(differential fluorescence induction，DFI)

5．6 体外转座进行基因组分析和作图(genomic analysis and mapping by in vivo transposition，GAMBIT)

5．7 体内诱导抗原技术(in vivo induced antigen technology，IVIAT)

参考文献

第二章 马链球菌兽疫亚种基因组表达文库的构建及鉴定

1 试验材料

1．1 菌株和载体

1．2 主要试剂及试剂盒

1．3 主要仪器设备

2 试验方法

2．1 软件模拟酶切

2．2 ATCC35246基因组的提取

2．3 最佳酶切条件的优化

2．4 DNA酶切片段的回收

2．5 表达质粒的提取

2．6 质粒的线性化和去磷酸化

2．7 载体的连接

2．8 电感受态细胞的制备与转化

3 试验结果

3．1 DNAstar模拟酶切

3．2 ATCC35246基因组的纯度及完整性

3．3 基因组酶切条件的优化

3．4 pET28系列表达载体提取、酶切及去磷酸化处理

3．5 基因组表达文库的构建

3．6 基因组表达文库插入率的分析

4 讨论

参考文献

第三章 马链球菌兽疫亚种基因组文库的免疫筛选、鉴定及功能预测

1 试验材料

1．1 主要试剂

1．2 主要仪器

2 康复血清的处理

2．1 康复血清的筛选

2．2 减数法去除交叉反应性抗体

2．3 间接ELISA检测吸附过程中抗体效价的动态变化

3 免疫筛选

3．1 初筛

3．2 复筛

3．3 阳性克隆的鉴定

4 结果

4．1 康复血清吸附结果

4．2 免疫筛选结果

5 讨论

参考文献

第四章 类胶原表面蛋白SclZ．5缺失株的构建

1 试验材料

1．1 菌株和载体

1．2 主要试剂及试剂盒

1．3 主要仪器设备

2 试验方法

2．1 引物的设计与合成

2．1 SclZ．5基因上、下游同源臂的扩增

2．2 基因缺失重组质粒的构建及鉴定

2．3 化学转化感受态细胞的制备

2．4 SclZ．5基因缺失株的构建与鉴定

3 试验结果

3．1 上、下游片段的扩增

3．2 重组质粒的构建与鉴定

3．3 缺失株的构建与鉴定

4 讨论

参考文献

全文总结

附录 试验所用试剂的配制方法

致谢