马链球菌兽疫亚种差异表达基因的鉴定及生物被膜态蛋白组学分析

摘要

马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ）是我国猪链球菌病的主要病原之一，可引起猪的败血症、脑膜炎和关节炎等，人食用被该菌污染的食物或是与患病动物密切接触亦可感染。本文利用选择性捕获转录序列(SCOTS)技术对SEZ在感染猪肺组织中和生物被膜态的差异表达基因进行了鉴定;对SEZ在以上两种状态下均出现差异表达的纤连蛋白结合蛋白(Fibronectin-binding protein，FNZ)基因进行了生物学功能分析;同时通过在体外建立生物被膜模型，比较了该菌生物被膜态与浮游态蛋白表达的差异。以上研究结果有助于阐明该病原菌的致病机理。
　　1.马链球菌兽疫亚种在感染猪肺组织中差异表达基因的鉴定
　　病原菌在宿主体内定殖与感染的过程是一个复杂的、动态的多因素作用过程，在这个过程中病原菌需要通过调控各基因的表达来适应环境的变化。揭示SEZ在感染过程中基因的差异表达情况，有助于了解SEZ在宿主体内的存活、增殖以及对宿主的致病机制。然而，SEZ在感染宿主体内的基因差异表达情况目前却未可知。本研究利用SCOTS技术对SEZ在感染猪肺组织中差异表达基因进行了筛选，并通过dot blot和Real-time PCR对差异表达基因进行验证，鉴定出45个差异表达基因。根据基因功能，45个基因可分为六类:代谢、细胞壁合成、应激、转运、转录以及未知功能。以上结果有助于深化对SEZ在体内感染状态下基因差异表达情况的认识。
　　2.马链球菌兽疫亚种生物被膜态差异表达基因的鉴定
　　生物被膜是细菌黏附于非生物或活性组织表面的一种微生物聚集群体，在细菌持续性感染过程中起重要作用。SEZ能否形成生物被膜？SEZ生物被膜状态下基因的表达情况如何目前均未见报道。本研究利用96孔微孔板法在体外建立了SEZ生物被膜模型，观察到了生物被膜形态。利用SCOTS技术对SEZ生物被膜态的差异表达基因进行了筛选，并通过dot blot和Real-time PCR对差异表达基因进行验证，鉴定出31个差异表达基因。根据基因功能，31个基因可分为代谢、细胞壁合成、应激、转运、转录、复制以及未知功能七类。以上研究丰富了生物被膜形成机制的认识，有助于进一步研究该菌持续性感染的致病机理。
　　3.马链球菌兽疫亚种FNZ基因功能分析
　　纤连蛋白结合蛋白基因(Fibronectin-binding protein，FNZ)是在感染猪肺组织和生物被膜态两种条件下均出现表达差异的基因，该基因在SEZ致病过程中的具体作用有待深入研究。利用温度敏感型穿梭自杀质粒载体pSET4s敲除SEZ ATCC35246的FNZ基因，构建了FNZ基因缺失株ΔFNZ;利用穿梭载体pSET2构建了互补株CΔFNZ。比较缺失株、互补株和野生株在细胞粘附、生物被膜形成能力、全血中的存活能力和毒力的差异，结果显示ΔFNZ和CΔFNZ具有较好的遗传稳定性;ΔFNZ粘附HEp-2细胞、形成生物被膜及在全血中的存活能力均下降;ΔFNZ对小鼠的LD50较野生株高10倍，在小鼠血液、肝脏、肺脏和脾脏组织的活菌数也有所下降。以上研究结果表明FNZ与SEZ的生物被膜形成、细胞粘附和致病性相关。
　　4.FNZ与FN结合部位的确定
　　文献报道，纤连蛋白结合蛋白(Fibronectin-binding protein，FNZ)从N-端开始315个aa（约占50％）具有结合FN的活性，但具体结合位置未见报道。五个FNZ基因片段N1(amino acids 38-197),N2(amino acids 38-603),N3(amino acids 41-315),N4(amino acids 192-370)和N5(amino acids 38-225)在大肠杆菌中融合表达，并利用配基印迹结合试验和ELISA检测各融合蛋白对FN的结合能力。结果表明，FNZ在N端192-225aa区域为具有FN结合活性的线性部位。
　　5.马链球菌兽疫亚种生物被膜态和浮游态比较蛋白组学分析
　　多种细菌生物被膜态的蛋白表达水平与浮游态之间存在差异，这些蛋白表达的差异可能与细菌导致的持续性感染相关。SEZ能够在体外形成生物被膜，但生物被膜状态下的蛋白表达水平差异还未可知。利用比较蛋白组学方法，分析了SEZ生物被膜态与浮游态全菌蛋白的表达差异。结果表明，在生物被膜态13个蛋白的表达水平上调，主要与代谢、粘附和应激相关;11个蛋白的表达水平下调，主要与蛋白合成等相关。该结果有利于进一步阐明生物被膜的形成机制。
　　6.生物被膜态马链球菌兽疫亚种免疫蛋白组学分析
　　采用感染猪的康复血清，对生物被膜态的全菌蛋白进行了免疫蛋白组学分析。结果鉴定出17种能与康复血清发生免疫反应的蛋白，其中8种蛋白为首次报道，另外9种蛋白在生物被膜态和浮游态均能与康复血清发生免疫反应。从两种状态下均具有免疫反应性的9种蛋白中选取3种蛋白holA、GroEL和ykgC进行克隆表达，并进行免疫保护评价，发现3种重组蛋白均能与SEZ感染猪的康复血清反应，对小鼠的免疫保护率分别为25％（holA）、62.5％（GroEL）和75％(ykgC)。表明GroEL和ykgC两种蛋白具有较好的免疫保护效力，可作为亚单位疫苗的候选分子。

目录

声明

摘要

第一章 细菌基因差异表达研究技术的进展

1 DNA芯片技术

2 mRNA差异显示技术

3 抑制性消减杂交技术

4 体内表达技术

5 代表性差异分析技术

6 选择性捕获转录序列

6．1 SCOTS技术原理

6．2 SCOTS技术的优缺点

6．3 SCOTS技术的应用

参考文献

第二章 生物被膜研究进展

1 生物被膜的形态结构

2 生物被膜的形成过程

3 细菌生物被膜的鉴定方法

3．1 试管法

3．2 微量板定量检测法

3．3 染色法

3．4 显微镜观察法

3．5 荧光法

4 动物病原微生物生物被膜形成情况

4．1 胸膜肺炎放线杆菌

4．2 嗜水气单胞菌

4．3 炭疽芽胞杆菌

4．4 副猪嗜血杆菌

4．5 葡萄球菌

4．6 大肠杆菌

4．7 链球菌

5 细菌生物被膜形成中的基因表达和蛋白表达

5．1 细菌生物被膜形成中的基因表达

5．2 细菌生物被膜形成中的蛋白表达差异

6 细菌生物被膜的耐受性

参考文献

第三章 马链球菌兽疫亚种在感染猪肺组织中差异表达基因的鉴定

1 材料与方法

1．1 菌株和质粒

1．2 试剂与仪器

1．3 实验动物

1．4 引物设计

1．5 ATCC35246基因组的提取与生物素标记

1．6 ATCC35246菌株rDNA的扩增

1．7 生物素标记的基因组和核糖体重组质粒的破碎

1．8 总RNA的提取与RNase-free DNase Ⅰ消化

1．9 双链cDNA的合成

1．10 选择性捕获转录序列(SCOTS)

1．11 SCOTS文库的克隆

1．12 斑点杂交技术筛选阳性克隆

1．13 阳性克隆的测序及分析

1．14 荧光定量PCR验证差异表达基因

2 结果

2．1 ATCC35246基因组的提取结果

2．2 ATCC35246菌株rDNA基因的扩增结果

2．3 ATCC35246基因组及rDNA重组质粒的破碎结果

2．4 实验动物的感染

2．5 总RNA的提取结果

2．6 SCOTS结果

2．7 差异表达基因的克隆

2．8 斑点杂交结果

2．9 感染相关基因的功能注释

2．10 差异表达基因的荧光定量PCR验证结果

3 讨论

参考文献

第四章 马链球菌兽疫亚种生物被膜态差异表达基因的鉴定

1 材料与方法

1．1 实验菌株与培养基

1．2 主要试剂及仪器

1．3 主要仪器及耗材

1．4 菌悬液的制备

1．5 体外生物被膜检测

1．6 SCOTS筛选差异表达基因

2 结果

2．1 马链球菌兽疫亚种不同株生物被膜形成能力比较

2．2 生物被膜形成周期

2．3 扫描电镜观察

2．4 总RNA的提取

2．5 SCOTS结果

2．6 差异表达基因的克隆

2．7 斑点杂交结果

2．8 生物被膜状态下差异表达基因的功能注释

2．9 差异表达基因的荧光定量PCR验证结果

3 讨论

参考文献

第五章 马链球菌兽疫亚种FNZ基因功能分析

1 材料与方法

1．1 菌株和质粒

1．2 试剂与仪器

1．3 ATCC35246 FNZ基因敲除突变株的构建和鉴定

1．4 基因缺失株和互补株的生物学特性研究

1．5 生物被膜形成能力试验

1．6 细胞粘附试验

1．7 细菌的全血存活试验

1．8 动物感染试验

1．9 黏附素的转录谱

2 结果

2．1 重组质粒pSET4s-L-R的构建及鉴定

2．2 基因缺失株的构建和鉴定

2．3 互补株的构建及鉴定

2．4 缺失株和互补株的主要生物学特性分析

2．5 生物被膜形成能力的测定

2．6 HEp-2的黏附测定

2．7 全血存活能力

2．8 粘附相关基因的转录

2．9 半数致死量(LD50)的测定

2．10 小鼠脏器细菌计数

3 讨论

参考文献

第六章 FNZ与FN结合部位的确定

1 材料与方法

1．1 菌株和质粒

1．2 引物设计

1．3 主要试剂

1．4 重组质粒的构建

1．5 重组融合蛋白的表达

1．6 重组融合蛋白的纯化

1．7 配基印迹结合试验

1．8 ELISA试验

2 结果

2．1 PCR鉴定结果

2．2 重组质粒酶切鉴定

2．3 重组质粒在BL21中的表达

2．4 融合蛋白的纯化结果

2．5 配体印迹试验结果

2．6 ELISA试验结果

3 讨论

参考文献

第七章 马链球菌兽疫亚种生物被膜态和浮游态比较蛋白组学分析

1 材料与方法

1．1 菌株和培养条件

1．2 主要试剂

1．3 菌体蛋白样品的制备

1．4 双向凝胶电泳

1．5 质谱测定及生物信息学分析

1．6 荧光定量PCR

2 结果

2．1 比较蛋白组学分析结果

2．2 荧光定量PCR结果

3 讨论

参考文献

第八章 生物被膜态马链球菌兽疫亚种免疫蛋白组学分析

1 材料与方法

1．1 菌株和培养条件

1．2 主要试剂

1．3 菌体蛋白样品的制备

1．4 双向凝胶电泳

1．5 制备猪康复血清

1．6 免疫印迹

1．7 重组蛋白的表达

1．8 纯化重组蛋白及免疫转印验证免疫反应性

1．9 亚单位疫苗的制备

1．10 亚单位疫苗对小鼠免疫效果评价

2 结果

2．1 免疫蛋白组学分析结果

2．2 重组菌的PCR鉴定和双酶切鉴定结果

2．3 SDS-PAGE及Western blot分析结果

2．4 亚单位疫苗免疫后各蛋白抗体水平检测

2．5 重组融合蛋白对小鼠的免疫保护效力

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

博士期间发表及待发表论文