大豆曲茎性状基因定位、表达谱及候选基因功能分析

摘要

大豆(Glycine max(L.) Merr.)原产于中国，是当今世界上最重要的植物蛋白与食用植物油的来源。我国大豆单产相对较低，提高产量是育种的首要目标。理想株型可提高光能利用效率，是重要育种目标，培育在群体及个体层面上与生态环境相适应的特异株型大豆是实现大豆高产突破的重要探索途径。曲茎是大豆株型育种中具有潜在利用价值的特异性状。大豆曲茎短节间、秆强抗倒伏，可用于高产环境下提高植株的抗倒能力;若能将这些性状结合到优良的遗传背景中，通过个体和群体产量的协调和提高，有望达到产量的突破。同时大豆曲茎作为茎秆生长异常突变，分离其基因可深入了解植物茎秆生长发育的遗传机制。在以往研究基础上，本文进一步利用多个杂交组合F2群体研究曲茎遗传，并进行基因定位，同时利用曲茎近等基因系材料进行表达谱差异基因分析，进而结合基因定位和芯片结果筛选调控曲茎发育的重要基因，研究其功能。主要结果如下:
　　 对20个不同的曲茎组合进行3正常∶1曲茎和15正常∶1曲茎的卡平方适合性测验。结果有10个符合3∶1的表型分离比例，2个符合15∶1的表型分离比例，表明曲茎可能由两对隐性基因控制;8个不符合上述分离比，可能与亲本遗传背景或外界环境因素影响有关。浙春3RH×NG94-156组合中曲茎植株株高、节数、总荚数和总粒数均显著低于正常株，而在NN1138-2M×NG94-156组合中曲茎植株的节数和粒数与正常株无显著差异，表明从杂交后代中可选出农艺性状优良的曲茎短节间高产材料。利用曲茎NN1138-2M× NG94-156杂交F2群体对曲茎基因定位结果进行验证，选取B2连锁群上两个区段（Gm14:30058525..33087558和Sat_424至染色体末端）的70个标记进行定位，通过结果分析最终将sb基因定位在SSR标记BARCSOYSSR_14_1415和BARCSOYSSR_14_1424之间，其物理距离约为240kb(Gm14:47661103..47901399)，通过生物信息学分析总共预测到17个候选基因。
　　 利用大豆Affymetrix基因组芯片检测TN01大豆曲茎近等基因系茎顶端组织转录组差异。通过筛选（fold change＞2，P＜0.01）得到了1384个差异基因，其中上调基因有899个，下调基因有485个。采用elimGO算法计算每个GO的显著性水平，筛选差异基因所显著影响的GO功能，共发现57个显著上调、38个显著下调的功能。筛选得到与曲茎相关的主要功能有:对赤霉素刺激的反应、氧化还原过程、细胞对重力的反应、赤霉素介导的信号途径、短日照光周期和开花的调节、对水杨酸刺激的反应、系统性获得免疫，水杨酸介导的信号途径、水杨酸生物合成过程的调节，筛选出6个与曲茎发育相关基因(Glyma14g38580、Glyma04g09350、 Glyma20g2728、Glyma11g04750、Glyma15g01500、Glyma09g27490)。采用Fisher精确检验计算信号转导通路的显著性水平，发现有10个通路显著上调，6个显著下调;GO分析发现的6个基因显著参与次级代谢产物的合成、苯丙氨酸的代谢、黄酮类化合物的生物合成、二萜类化合物的生物合成等途径。共表达网络分析发现这些基因在野生型和突变型之间发生了显著变化，相对比较活跃。
　　 根据基因定位区段候选基因分析和表达谱芯片差异基因分析结果筛选出与曲茎发育相关重要基因Glyma14g38580，该基因编码肉桂酸4-羟化酶(CINNAMATE-4-HYDROXYLASE，C4H)。C4H是苯丙烷途径中第二个关键的酶，催化苯丙烷途径的第二步反应。利用10个材料进行扩增GmC4H基因测序，结果显示突变体和野生型之间只有碱基的差异，没有氨基酸的差异。进一步利用两对近等基因系材料对该基因进行荧光定量分析，发现该基因是下调的，其在野生和突变体中的表现趋势与表达谱芯片结果一致。共表达分析发现在突变体中有16个和Glyma14g38580共表达的基因，而在野生型中只有5个基因。
　　 PPR基因家族在植物的生长发育和细胞器的发生过程中具有不可或缺的作用，前人研究推测GmPPR1基因可能是曲茎重要候选基因。将已克隆的GmPPR1基因构建载体转化拟南芥，通过潮霉素、GUS染色以及分子检测共获得12株转基因植株。与正常植株相比，转基因植株茎秆不够粗壮，表现为弯曲匍匐，并且出现早熟的性状。GmPPR1对曲茎的调控作用有待进一步研究。

目录

声明

摘要

缩略词表及英汉对照

第一章 文献综述

1．1 作物株型育种研究概况

1．1．1 植物株型的概念

1．1．2 主要农作物株型遗传育种研究概况

1．1．3 大豆株型育种研究

1．2 植物曲茎形态的遗传与育种利用研究

1．2．1 植物茎形态特点与遗传育种研究

1．2．2 曲茎性状的遗传调控机制

1．2．3 大豆曲茎研究进展

1．3 图位克隆技术

1．3．1 图位克隆技术的原理

1．3．2 图位克隆的技术环节

1．3．3 大豆基因图位克隆研究进展

1．4 基因芯片技术

1．4．1 基因芯片的测序原理

1．4．2 基因芯片的类型

1．4．3 基因芯片和待分析样品的制备

1．4．4 基因芯片技术在农作物上的应用

1．4．5 展望

1．5 本研究的目的和意义

第二章 大豆曲茎基因的定位与候选基因分析

2．1 试验材料

2．2 实验方法

2．2．1 田间试验及性状调查

2．2．2 大豆叶片DNA提取

2．2．3 SSR引物

2．2．4 PCR扩增

2．2．5 PAGE检测

2．2．6 候选基因的预测分析

2．3 结果分析

2．3．1 大豆曲茎性状的遗传分析

2．3．2 农艺性状的调查和分析

2．3．3 大豆曲茎突变体sb基因的定位

2．3．4 候选区段的基因分析

2．4 讨论

第三章 大豆曲茎近等基因系的基因表达谱分析

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．2．1 大豆曲茎材料种植和处理

3．2．2 总RNA的提取

3．2．3 芯片的制备

3．2．4 荧光定量PCR

3．3 结果分析

3．3．1 总RNA质检结果

3．3．2 原始数据的归一化

3．3．3 差异基因的筛选

3．3．4 基因芯片数据的聚类分析

3．3．5 差异基因生物学功能分析

3．3．6 差异基因信号转导通路分析

3．3．7 共表达网络分析

3．3．8 芯片可靠性的验证

3．4 讨论

3．4．1 影响芯片结果准确性的因素

3．4．2 曲茎重要候选基因的筛选

第四章 大豆曲茎相关基因GmC4H1的表达鉴定

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 RNA提取

4．2．2 RT-PCR反应

4．2．3 基因扩增的PCR反应

4．2．4 琼脂糖凝胶的制备

4．2．5 PCR产物的回收

4．2．6 连接、转化及转化子的筛选

4．2．7 荧光定量PCR

4．3 结果分析

4．3．1 GmC4H1序列分析

4．3．2 GmC4H1荧光定量分析

4．3．3 GmC4H1共表达基因分析

4．4 讨论

4．4．1 细胞色素P450家族

4．4．2 植物C4H基因的功能

4．4．3 与GmC4H1共表达的基因

第五章 曲茎候选基因GmPPR1的功能鉴定

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．2．1 载体信息

5．2．2 表达载体构建

5．2．3 表达载体转化农杆菌

5．2．4 GmPPR1基因转化拟南芥

5．2．5 转基因植株的筛选

5．2．6 分子鉴定

5．3 结果分析

5．3．1 植物表达载体的构建及检测

5．3．2 农杆菌转化子的检测

5．3．3 GUS染色检测

5．3．4 分子检测

5．3．5 转基因植株的观察

5．4 讨论

全文结论与创新之处

参考文献

附录

致谢