嗜水气单胞菌J-1株ahyI基因缺失株的构建特性分析

摘要

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是哺乳动物和水产动物重要的条件致病菌，具有一系列的毒力因子，包括溶血素、肠毒素、细胞毒素、甘油磷脂胆固醇酰基转移酶和丝氨酸蛋白酶等。有研究表明群体感应系统可以调控毒力因子的产生。
　　 群体感应系统1(QS1)广泛存在于革兰阴性菌中，AhyI是嗜水气单胞菌QS1信号分子合成酶。本试验根据嗜水气单胞菌ATCC7966的ahyI基因序列设计并合成引物，以嗜水气单胞菌J-1株DNA为模板进行PCR的检测和分析，可扩增到952bp片段，通过Blast比对，发现与嗜水气单胞菌ATCC7966及嗜水气单胞菌SSU的ahyI基因同源性很高，分别为99％、96％。用PCR方法检测ahyI基因在115株不同来源、不同地区气单胞菌中的分布，结果表明22株嗜水气单胞菌中检出，阳性率为100％，且特异性高，说明ahyI基因在嗜水气单胞菌中有一定的保守性。维氏气单胞菌（A.veronii）ahyI基因的检出率为50％(34/68)，在14株温和气单胞菌(A.sobria)和7株库蚊气单胞菌(A.culicicola)中分别有9株和3株为阳性。ahyI基因在健康、发病鱼以及水体中没有明显的特征分布。
　　 根据嗜水气单胞菌ATCC7966的基因组设计两对引物，分别扩增嗜水气单胞菌J-1株ahyI基因的上游870bp和下游920bp，将氯霉素基因插入上下游之间，构建缺失ahyI基因的自杀性质粒pHM5（ahyI）。将重组的自杀性质粒转入EcoliSM10，用滤膜接合法将重组质粒转入嗜水气单胞菌J-1株，通过抗性以及蔗糖筛选出双交换的缺失株，并利用pUC18载体构建该基因的互补株。对缺失株、野生株及互补株的生物学特性进行分析，结果发现，hyI基因缺失后，菌株不能合成AI-1，但对AI-2的影响不显著。缺失株的胞外蛋白酶活性下降，通过SDS-PAGE比较发现，胞外蛋白图谱与J-1株明显不同;RT-PCR显示，丝氨酸蛋白酶基因表达降低。与J-1株相比，缺失株对Hep2细胞的黏附力和对EPC细胞的侵袭力都下降，但是在斑马鱼的半数致死量上与J-1株相同。
　　 ahyI基因的敲除使嗜水气单胞菌无法合成信号分子AI-1，且胞外蛋白酶的活性、丝氨酸蛋白酶的表达、对Hep2细胞的黏附力以及对EPC细胞的侵袭力都受到不同程度的影响，但这些改变并没有对嗜水气单胞菌J-1的致病性产生明显影响。

目录

声明

摘要

第一章 嗜水气单胞菌毒力因子的研究进展

1 外毒素(exotoxin)

1．1 气溶素(Aerolysin)

1．2 溶血毒素(hemolytic toxin)

1．3 细胞毒性肠毒素(Cytotoxic enteroxin)

1．4 HEC毒素

2 胞外酶类

2．1 胞外蛋白酶(Extracellular protease)

2．2 磷脂酶(Phospholipase)

2．3 核糖核酸酶

3 黏附因子

3．1 S层

3．2 菌毛(Fimbriae)

3．3 外膜蛋白

3．4 脂多糖

4 生物被膜(biofilm)

5 展望

参考文献

第二章 群体感应系统1的研究进展

1 QS1的机制

2 QS与致病性

2．1 QS与生物被膜

2．2 QS与TTSS

2．3 QS1与其他毒力因子

参考文献

第三章 ahyⅠ基因的在不同来源气单胞菌中的分布

1 材料与方法

1．1 菌株及培养

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 嗜水气单胞菌J-1株ahyⅠ基因的检测分析

1．5 PCR检测不同来源气单胞菌中ahyⅠ基因的分布

2 结果

2．1 嗜水气单胞菌J-1株ahyⅠ基因的分析

2．2 PCR检测不同来源气单胞菌ahyⅠ基因分布

3 讨论

参考文献

第四章 嗜水气单胞菌ahyⅠ基因缺失株的构建

1 材料与方法

1．1 菌株和质粒

1．2 主要试剂与仪器

1．3 ahyⅠ基因缺失株的构建

1．4 互补株的构建

2 结果

2．1 缺失株的构建

2．2 互补株的构建

3 讨论

参考文献

第五章 嗜水气单胞菌ahyⅠ基因缺失株的特性分析

1 材料与方法

1．1 菌株和质粒

1．2 主要试剂与仪器

1．3 特性分析

2 结果

2．1 生长曲线

2．2 AI-1产生水平的比较

2．3 AI-2产生水平的比较

2．4 溶血价的测定

2．5 胞外蛋白酶活性

2．6 全菌蛋白SDS-PAGE

2．7 胞外产物SDS-PAGE

2．8 外膜蛋白SDS-PAGE

2．9 细胞黏附

2．10 细胞侵袭

2．11 生物被膜

2．12 半数致死量

2．13 荧光定量PCR进行基因表达量分析

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢