转Bt基因稻米加工品的LAMP检测方法的建立

摘要

近年来，由于转基因食品的安全性问题，欧盟、美国、日本及我国等许多国家都相继制定了转基因生物的管理法规，对转基因食品采取标签管理和溯源管理制度。2012年，中国出口到欧盟的米制品，由于被检出含有转基因成分，频频遭到审查和公告撤架。因此，为保护我国的贸易出口，迫切需要建立一种准确、特异、快速的转基因米制品检测方法。
　　 环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是一种新颖恒温核酸扩增方法，与传统PCR方法相比，具有灵敏度高、特异性好、简单快速、不需要特殊仪器等优点。目前这项技术在转基因玉米和大豆以及转基因饲料的分子检测领域得到了广泛的应用，而在转基因稻米检测中的研究很少。
　　 本研究针对转Bt基因水稻的外源Cry1Ac基因(GeneBank accession numberY09787)，利用LAMP技术，用LAMP引物在线设计软件设计引物，并对镁离子浓度、Bst DNA聚合酶浓度、反应温度、反应时间等扩增条件进行优化，建立了LAMP反应体系。
　　 建立的LAMP反应体系如下（25μL体系）:F3和B3（LAMP反应外引物）各0.1μM，FIP和BIP（LAMP反应内引物）各1.28μM，3 mM MgCl2，2.8 mM dNTP，5 M betaine，6.4 U Bst DNA聚合酶大片段，2.5μL Bst DNA聚合酶缓冲液(20 mMTris-HCl(pH8.8,25C),10 mM KCl,10 mM(NH4)2SO4,2 mM MgSO4,0.1％TritonX-100)，100 ng DNA模板。扩增反应条件为:61℃保存1h，80℃灭活10 min。LAMP反应结果可以将产物在2％琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪上观察，如果产生阶梯型条带则说明有扩增发生。也可以直接向产物中加入荧光染料1000× SybrGreenⅠ混匀后观察颜色变化，如果溶液由桔黄色变为绿色则为阳性，否则为阴性。
　　 此外，对LAMP引物的特异性分别进行了LAMP反应和PCR反应验证，结果表明:转基因水稻结果为阳性，其他样品均为阴性，对扩增产物进行进一步的测序结果也与此相符。建立的LAMP方法的实物检测限为0.005％，阳性质粒检测限为10拷贝，灵敏度比普通PCR高10倍。
　　 食品在加工过程中由于高温、高压、酸碱、发酵和剪切力等物理、化学因素的影响，DNA容易发生降解，这使得转基因作物加工品的检测具有一定难度。本研究用建立的LAMP检测方法对稻米加工品——米饭和米酒进行检测，结果表明该方法可以准确有效的检测出经过蒸煮、发酵1d、2d、3d的转基因稻米加工品。
　　 总之，建立的LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、操作简便、耗时短，可用于市场中转Bt基因稻米及其加工品的快速检测，为转基因食品监管提供技术支持。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照表

1 引言

1．1 立题背景及意义

1．2 转基因水稻研究现状

1．2．1 抗虫转基因水稻

1．2．2 抗病转基因水稻

1．2．3 抗除草剂转基因水稻

1．2．4 抗逆转基因水稻

1．2．5 其它转基因水稻

1．3 转基因检测技术研究进展

1．3．1 蛋白质水平上的检测技术

1．3．2 核酸水平的检测技术

1．3．3 其他检测技术

1．4 环介导等温扩增技术

1．4．1 环介导等温扩增技术概述

1．4．2 环介导等温技术的引物设计

1．4．3 环介导等温技术的基本原理

1．4．4 环介导等温技术的特点

1．4．5 环介导等温技术的产物检测方法

1．4．6 环介导等温技术在转基因检测中的应用

2 材料与方法

2．1 材料与试剂

2．1．1 试验材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 水稻基因组DNA提取方法

2．2．2 模板DNA的浓度及质量检测

2．2．3 LAMP反应引物设计

2．2．4 引物的处理

2．2．5 反应体系及反应条件

2．2．6 反应产物的检测方法

2．2．7 LAMP反应条件优化

2．2．8 LAMP引物特异性试验

2．2．9 LAMP灵敏度试验

2．2．10 稻米加工品的LAMP检测

3 结果与分析

3．1 模板DNA浓度测定结果分析

3．2 模板DNA质量结果分析

3．3 LAMP反应条件优化

3．3．1 Mg2+浓度优化

3．3．2 Bst DNA聚合酶量优化

3．3．3 反应温度的优化

3．3．4 反应时间优化

3．4 引物特异性试验

3．4．1 LAMP引物特异性试验

3．4．2 PCR引物特异性试验

3．5 LAMP灵敏度试验

3．5．1 实物样品灵敏度试验

3．5．2 阳性重组质粒质粒灵敏度试验

3．6 稻米加工品的LAMP检测

3．6．1 稻米加工品的制作

3．6．2 稻米加工品的LAMP检测结果

4 讨论

4．1 稻米基因组DNA的提取及质量检测

4．2 引物的设计

4．3 反应程序的优化

4．3．1 镁离子浓度

4．3．2 DNA聚合酶浓度

4．3．3 反应温度与反应时间

4．4 污染的防治措施

4．5 转基因稻米的加工品检测

4．6 LAMP方法发展的建议

5 结论

参考文献

创新点

致谢

攻读硕士学位期间论文发表情况