葡萄SnRK2基因家族的全基因组鉴定、表达分析及VvSnRK2.2基因的功能验证

摘要

葡萄(Vitis vinifera L.)是葡萄科葡萄属落叶藤本植物，是世界上广泛栽培的重要经济果树之一。随着社会的发展和人口的增多，环境日益恶化。干旱、盐渍化、高温、低温以及氧化胁迫等都严重影响植物的生长和发育，进而影响果树的产量和品质，因而提高植物的抗逆性成为当前农业研究的主要目标之一。SnRK2（蔗糖非发酵1型相关蛋白激酶2;Sucrose non-fermenting 1-related protein kinases 2），是植物体所特有的一类丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶。研究表明，SnRK2家族成员在植物的生长和发育过程中起着重要的作用，包括细胞分化、植物代谢、细胞内的信号转录以及对干旱、极端温度和盐渍化等非生物胁迫的响应等。本论文的主要研究内容包括以下三个方面:
　　1、运用生物信息学的方法，从全基因组水平上鉴定葡萄SnRK2家族成员基因，并对其系统发生、理化性质、二级结构、基因结构、motif、C末端序列和EST等方面进行预测和分析;
　　2、利用基因芯片数据和荧光定量RT-PCR对葡萄SnRK2家族基因在组织/器官发育及不同生物/非生物胁迫处理条件下的表达模式进行了分析;
　　3、在5BB中克隆了VvSnRK2.2基因，成功构建了过量表达载体，并利用花粉管通道法转化拟南芥，以进一步了解其功能。
　　主要结果如下:
　　1.利用隐马可夫模型(HMM)搜索和系统建树的方法，在葡萄中共鉴定出了6个VvSnRK2基因，并对其进行了理化性质、二级结构、基因结构、motif、C末端和EST等的预测和分析。结果表明，葡萄VvSnRK2家族为亲水性蛋白，二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主;在系谱发生上葡萄VvSnRK2s蛋白分为3个亚族;基因结构分析表明，葡萄中6个基因的外显子和内含子的分布非常保守，所有基因都含有9个外显子，并且除了VvSnRK2.3基因的内含子插入位点为1相位之外，所有基因内含子的插入位点都为0相位;motif和C末端序列分析表明，葡萄SnRK2基因家族具有较高的保守性;EST分析表明，6个基因在10个组织中呈不均匀分布，其中主要分布在果实、细胞悬浮物、叶片和花中。
　　2.利用芯片数据分析了葡萄中6个SnRK2基因在组织/器官发育及生物/非生物胁迫处理条件下的表达模式。组织发育芯片数据表明，VvSnRK2s参与种子发育及果实的发育和衰老，并受到生物和非生物胁迫的诱导。在种子发育中，VvSnRK2.1、VvSnRK2.2和VvSnRK2.3主要表现为上调表达，VvSnRK2.5为下调表达。在果实发育和衰老过程中，多数VvSnRK2基因都表现为下调表达，且以VvSnRK2.5下调表达最为显著;在生物/非生物胁迫芯片数据分析中，VvSnRK2.6受白粉病和高温的诱导，而VvSnRK2.1受水分胁迫和盐的诱导;ABA的芯片数据分析结果与文献报道相一致，即第一亚家族不受ABA的诱导，第二亚家族受ABA的微弱诱导，第三亚家族受ABA的强烈诱导。
　　3.为了进一步了解葡萄中6个SnRK2（VvSnRK2.1-VvSnRK2.6)基因的表达模式及功能，我们利用荧光定量RT-PCR的方法分析了这6个基因在ABA、干旱、NaCl、高温(45℃)和低温(4℃)等处理条件下的表达情况。结果表明，VvSnRK2.1在干旱和NaCl处理后显著上调表达，与芯片数据相一致;VvSnRK2.2和VvSnRK2.4受到高温的诱导;VvSnRK2.3受低温的诱导;VvSnRK2.1和VvSnRK2.5受ABA的显著诱导。
　　4.为了进一步验证葡萄VvSnRK2家族基因的功能，我们从葡萄砧木5BB中克隆了VvSnRK2.2基因，构建了植物双元表达载体(35S:VvSnRK2.2)，转化农杆菌，并利用花粉管通道法转化拟南芥，初步GUS染色获得了6个抗性株系，利用RT-PCR对2株抗性株系L34和L42进行了检测。以转基因拟南芥T3代种子和幼苗为材料，对转基因拟南芥进行了非生物胁迫抗性分析，结果表明，在ABA(10μM和50μM)处理培养基上，L34和L42转基因株系比野生型(WT)的反应更加敏感，且在对照(CK)和各种处理培养基上转基因拟南芥的叶片生长正常，而野生型(WT)叶片在ABA培养基上生长6天后表现为上翘（或向上卷曲），初步推测，该基因可能与气孔的运动或叶片组织结构有关系;通过植物抗旱性分析，证明VvSnRK2.2能够提高拟南芥对干旱的抗性，而在NaCl处理条件下，转基因株系比对照更加敏感。

目录

声明

摘要

缩略语

引言

第一章 文献综述

1 蛋白激酶

1．1 蛋白激酶的分类

1．2 植物蛋白激酶研究进展

2 SnRK2蛋白激酶家族结构

3 SnRK2蛋白激酶的活性及表达

4 SnRK2蛋白激酶家族的调控网络

5 本研究的目的和意义

参考文献

第二章 葡萄SnRK2基因家族的全基因组鉴定和生物信息学分析

1 材料和方法

1．1 数据库的搜索

1．2 序列分析和系统进化树的构建

1．3 SnRK2蛋白质结构分析

1．4 SnRK2基因结构分析

1．5 SnRK2 C-末端motif分析

1．6 SnRK2 C-末端序列比对分析

1．7 SnRK2的EST分析

2 结果与分析

2．1 葡萄SnRK2候选基因的确定和染色体的定位

2．2 葡萄SnRK2蛋白质理化性质分析

2．3 葡萄SnRK2蛋白二级结构分析

2．4 葡萄SnRK2的系谱发生

2．5 葡萄SnRK2的基因结构分析

2．6 葡萄SnRK2的C末端motif分析

2．7 葡萄SnRK2 C-末端序列比对分析

2．8 葡萄SnRK2的EST表达分析

3 讨论

参考文献

第三章 葡萄SnRK2家族基因的表达分析

1 材料和方法

1．1 芯片数据

1．2 材料和处理

1．3 引物

1．4 试剂和仪器

1．5 方法

2 结果与分析

2．1 葡萄SnRK2基于芯片数据的表达分析

2．2 葡萄SnRK2基于荧光定量PCR(qRT-PCR)的表达分析

3 讨论

参考文献

第四章 葡萄VvSnRK2．2的克隆、序列分析及拟南芥遗传转化

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 基因的克隆与序列分析

2．2 植物表达载体的构建

2．3 拟南芥转基因株系的检测

3 讨论

参考文献

第五章 VvSnRK2．2基因的功能验证

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 野生型拟南芥和转基因株系的发芽状态

2．2 野生型拟南芥和转基因株系的初生根长度

2．3 野生型拟南芥和转基因株系非生物胁迫抗性分析

3 讨论

参考文献

全文结论

主要创新点

附录

攻读硕士学位期间所发表论文

致谢