苹果斑点落叶病病菌侵染过程、抗感病SSR分子标记开发及其在种质资源评价中的应用

摘要

苹果斑点落叶病是一种世界范围的真菌病害，在全球的苹果主产区普遍发生。利用抗性苹果资源，开展抗病性育种研究具有重要理论价值和实践意义。本研究对苹果斑点落叶病致病菌---链格孢属苹果专化型真菌（Alternariaalternataapplepathotype）从组织细胞学角度，利用石蜡切片技术和光学显微镜对病菌侵染过程进行观察，系统研究了苹果斑点落叶病病菌在苹果叶片上从分生孢子的附着、萌发，到入侵、扩展和定殖，直至产生子实体（无性阶段）的时空变化过程，动态掌握了苹果斑点落叶病病菌在苹果叶片上的侵染进程。本研究还以苹果‘金冠’和‘华脆’及其杂交群体为材料，通过对两个亲本‘金冠’、‘华脆’及杂交F1代单株抗病性的田间鉴定与室内鉴定，分析了苹果斑点落叶病的抗病性遗传规律。在此基础上，开展了苹果斑点落叶病与抗感病相关基因连锁的SSR分子标记筛选，获得了与苹果斑点落叶病感病基因连锁的分子标记。另外，依托位于美国农业部下属的苹果资源圃，对110个美国品种及新疆野苹果中的567个株系进行了接种试验，鉴定了它们对苹果斑点落叶病的抗病性等级，并且通过分子标记技术，对其中的部分株系及品种进行了抗病性鉴定。
　　本研究获得的主要结果如下:
　　1.对链格孢属苹果专化型真菌侵染苹果叶片的侵染过程进行了细胞学研究。观察表明:从接种后3天到接种后10天，明显观察到寄主植物组织细胞坏死范围从海绵组织向栅栏组织的扩展，并且细胞受损程度逐渐增大。接种10d后，病情进一步发展，病菌产生大量的繁殖结构，在寄主表面分化出分生孢子梗和分生孢子。同时，病菌在叶片表面的侵染面积迅速扩大，不断的分化出分生孢子梗，从而产生大量的分生孢子。据本研究观察，苹果斑点落叶病病菌几乎可以从苹果叶片表皮任何部位侵入，但是尚未发现该病菌由气孔入侵的现象。观察到苹果斑点落叶病病菌通过芽管顶端分化形成的附着孢侵入寄主，并发现报道了该病菌产生的以分生孢子梗（束）分化分生孢子的繁殖结构。
　　2.本研究对中国国家苹果资源圃的抗性品种‘华脆’和感病品种‘金冠’杂交的F1后代（14年生的亲本植株各10株，F1后代群体包括110个单株）进行了连续两年（2008年和2009年）的抗病性鉴定。以2007年田间接种试验评估数据为基础，对供试材料进行离体叶片和活体植株的人工接种试验，鉴定了110株F1后代的抗病等级。应用‘金冠’、‘华脆’对80个SSR引物进行了筛选，其中有14个引物在两个亲本和杂交后代的抗、感基因池（每池6个单株）中扩增出了稳定、可重复的多态性条带。通过建立两个亲本和抗感基因池，筛选出的引物CH05g07能够在感病基因池及感病亲本中扩增出特异片段。用该引物在F1后代110株单株中进行验证，有103个单株的结果与此一致，与田间及接种评价的结果也是一致的。为了进一步验证该标记的准确性，又利用20个苹果品种进行验证，结果与已有的抗病性评价相符。经统计计算，该分子标记的遗传距离为5.6cM，由此证明CH05g07-163片段为与苹果斑点落叶病感病基因连锁的SSR标记。
　　3.本研究对567个株系进行了苹果斑点落叶病抗性评价，通过文献搜索获得这些单株对苹果黑星病的抗性鉴定结果，选取了60个抗黑星病株系进行苹果斑点落叶病的抗病性分析。2011年和2012年连续两年对其进行了田间调查和离体叶片接种试验，16个株系被判定为对苹果斑点落叶病感病，44个株系为抗病（其中16个为完全免疫，3个为中度抗病）。对60个抗黑星病株系进行了SSR-PCR和RAPD-PCR扩增分析，CH05g07-163和S428-854片段分别出现在感病株系和抗病株系的PCR扩增分析中，与田间鉴定的结果一致。通过经USDA统计的果实性状相关信息，综合抗病性评价，认为编号为4、13、15、18、19、22、24、30、38、49的植株同时具有对苹果斑点落叶病和苹果黑星病的抗性，并且拥有较好的果实性状，果肉风味芳香，果实着色面积大，果实横径均大于5cM。
　　4.本研究依托美国农业部丰富的苹果品种资源，选取了110个美国培育的苹果品种作为试验对象。通过连续两年的田间抗病性调查、离体叶片接种试验以及分子标记辅助技术，对这110个苹果品种进行了苹果斑点落叶病抗感性评价。研究结果为:用两对引物（一对RAPD引物和一对SSR引物）对110个苹果品种中的50个品种的DNA进行了PCR扩增，结果显示其中的17株感病品种扩增出了CH05g07-163片段，而抗病品种中没有出现该特异片段。然而有两个被鉴定为抗病等级为MR的品种‘Priscilla’和‘Blackbendavis’被扩增出了与感病相关的SSR特异片段。而且RAPD-PCR扩增后也没有抗性条带出现，最终确定这两个品种为感病品种。研究中，将多重抗病性作为选择标准，鉴定出有6个品种同时具有抗斑点落叶病、抗火疫病和抗苹果黑星病的优良品种，即‘Dayton’、‘Puregold’、‘MildewImmuneSeedling’、‘PacificGold’、‘PumpkinSweet’、‘Pricilla’。

目录

声明

摘要

缩略词

引言

第一章 文献综述

1 苹果产业概况及育种进展

2 苹果斑点落叶病及其危害

2．1 苹果斑点落叶病的病原学

2．2 苹果斑点落叶病的发生与危害

2．3 苹果斑点落叶病的症状

2．4 苹果斑点落叶病的防治

3 分子标记技术在苹果遗传育种上的研究与应用

3．1 分子标记的种类概述

3．2 SSR分子标记

3．3 RAPD分子标记

4 植物病原真菌与寄主互作的组织病理学和细胞学研究

4．1 组织病理学的原理、方法及应用

4．2 细胞学原理、方法及应用

第二章 苹果斑点落叶病病菌侵染过程的组织细胞学研究

1 材料和方法

1．1 植物材料的准备

1．2 供试病原菌培养和接种体的准备

1．3 接种及培养方法

1．4 叶片表面染色和分生孢子萌发率统计

1．5 石蜡切片的取样、制作与观察

2 结果和分析

2．1 分生孢子在叶面的附着和萌发

2．2 苹果斑点落叶病病菌的侵入

2．3 苹果斑点落叶病病菌在寄主组织中的扩展和定殖

2．4 苹果斑点落叶病病菌无性阶段子实体的产生

3 结论和讨论

第三章 苹果斑点落叶病抗性遗传分析与SSR分子标记

1 引言

2 苹果斑点落叶病抗病性的田间接种及离体接种鉴定

2．1 供试材料

2．2 试验方法

2．3 试验结果

3 苹果斑点落叶病抗病性遗传规律分析

3．1 供试材料

3．2 分析方法

3．3 试验结果

4 苹果斑点落叶病抗感性相关SSR分子标记的筛选

4．1 试验材料

4．2 试验方法

5 结果与分析

5．1 与苹果斑点落叶病感病基因连锁的SSR标记的筛选

5．2 SSR分子标记在部分苹果品种中的验证

5．3 SSR分子标记与苹果斑点落叶病感病基因之间的遗传连锁分析

6 讨论

第四章 新疆野苹果资源对苹果斑点落叶病的抗性鉴定

1 引言

2 材料与试验方法

2．1 供试材料

2．2 供试菌株来源及活化培养

2．3 田间调查和离体接种鉴定

2．4 SSR-PCR

2．5 RAPD-PCR

3 结果与分析

3．1 苹果斑点落叶病抗病性鉴定结果

3．2 分子标记鉴定结果

4 讨论

第五章 苹果斑点落叶病抗病性种质评价

1 引言

2 供试材料

3 试验方法

3．1 田间调查及离体叶片接种鉴定

3．2 SSR-PCR

3．3 RAPD-PCR

3．4 病害评价及统计方法

4 结果与分析

4．1 田间调查结果及离体叶片接种鉴定结果

4．2 分子标记鉴定结果

5 讨论

全文结论

创新点

参考文献

附录1 本文中所用引物列表

附录2 60个新疆野苹果株系对苹果黑星病抗性统计及果实性状描述(数据来源USDA)

附录3 110个美国栽培品种对苹果火疫病的抗性统计表(数据来自USDA)

攻读博士学位期间发表论文及获奖情况

致谢