DNA四面体-CpG复合结构激活细胞免疫

摘要

CpG是由非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤脱氧核苷酸组成的而核苷酸基序，广泛存在于细菌的基因组中，具有免疫刺激作用。人工合成的含有CpG的寡聚脱氧核糖核苷酸(CpGODN)可以模拟细菌内CpG序列的免疫刺激活性，可以被被哺乳动物的免疫系统视为“外源威胁”，从而诱发机体的免疫应答。所以，CpGODN具有成为治疗性DNA或免疫佐剂的潜在能力，在治疗普通疾病甚至癌症的过程中发挥辅助治疗的作用。但是，未甲基化的CpGODN易降解，且不易被细胞摄取，需要反复给药并且提高给药剂量，这是严重限制CpG应用的一大缺陷。随着纳米技术的发展，为药用CpG的体内递送提供了新的方法。现有的大量研究报道证明，由纳米材料载带的CpG表现出了活性高、细胞毒性低、生物相容性好等新特点，有成为某些疾病治疗和预防的新型免疫制剂的潜能。我们将不同数目的CpG序列与DNA四面体结合，得到不同价态的CpG-四面体复合结构，研究了该复合结构的细胞毒性和摄取率以及进入细胞后结构的稳定性，并评估了它们的免疫刺激效果:我们发现DNA四面体-CpG结构在没有转染试剂辅助的情况下DNA四面体可以有效地携带CpG基序进入小鼠巨噬样细胞Raw264.7，不会产生细胞毒性，能在细胞内稳定存在8小时以上，并刺激细胞产生免疫应答;随着四面体上负载的CpG序列数量增加，免疫刺激性也随之增强;另外我们还发现，负载四段CpG序列的四面体能引起更强的免疫刺激效果。我们首次实现了DNA四面体在药物递送上的应用，并且克服了CpG序列易降解和细胞摄取率低的问题，为CpG在疾病防治方面的研究提供了新的思路和方法。相信DNA四面体结构也将成为一个有前途的靶向给药工具。

目录

声明

摘要

符号及缩略语等的说明

第一章 综述

1．1 CpG序列的性质、功能与应用

1．1．1 CpG序列的性质

1．1．2 CpG序列的功能与作用机制

1．1．3 CpG序列的应用

1．2 CpG序列与纳米材料

1．2．1 CpG药用研究的瓶颈

1．2．2 CpG对载体性质的要求

1．2．3 CpG与无机纳米材料

1．2．4 CpG与阳离子脂质体／聚合物

1．2．5 DNA纳米材料与CpG

1．2．6 纳米材料载带CpG的前景展望

1．3 DNA四面体

1．3．1 DNA纳米材料的发展

1．3．2 DNA四面体的设计、合成与表征

1．3．3 DNA四面体的研究进展

参考文献

第二章 DNA四面体-CpG系统的构建及其稳定性研究

2．1 引言

2．2 仪器与试剂

2．2．1 仪器

2．2．2 试剂

2．2．3 常用溶液的配置

2．3 DNA四面体-CpG复合结构的设计

2．4 DNA四面体-CpG复合结构的合成与表征

2．4．1 DNA的定量

2．4．2 DNA四面体-CpG的合成

2．4．3 DNA四面体-CpG的表征

2．5 DNA四面体结构的稳定性研究

2．5．1 DNA四面体体外抗降解实验

2．5．2 DNA四面体结构细胞内稳定性研究

2．6 小结

参考文献

第三章 DNA四面体-CpG复合结构免疫效应的研究

3．1 引言

3．2 仪器与试剂

3．2．1 仪器

3．2．2 试剂

3．2．3 常用溶液配置

3．3 实验方法

3．3．1 细胞培养

3．3．2 激光共聚焦显微镜成像

3．3．3 流式细胞检测

3．3．4 ELISIA

3．3．5 MTT

3．4 DNA四面体细胞摄取效率研究

3．4．1 激光共聚焦显微镜成像研究DNA四面体细胞摄取

3．4．2 流式细胞分析DNA四面体细胞摄取效率

3．5 DNA四面体-CpG细胞毒性研究

3．6 DNA四面体-CpG免疫效应的研究

3．6．1 不同价态DNA四面体-CpG的免疫效应

3．6．2 不同浓度DNA四面体-CpG的免疫效应

3．6．3 对TLR9下游通路其它细胞因子分泌的影响

3．7 小结

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文