脂肽类生物表面活性剂的提取工艺及其乳化性的研究

摘要

脂肽类生物表面活性剂（LipopeptidesBiosurfactants）主要是由芽孢杆菌产生的一类胞外分泌的次级代谢产物。它们具有生物相容性、生物降解性、较高的表面活性及抗菌活性等特性，其超强的表面活性被广泛应用于石油开采、环境治理、生物医疗、农业、化妆品和食品工业等领域。目前，对脂肽类表面活性剂研究较多的是表面活性素(surfactin)，但由于生产成本等方面的原因，难以大规模的工业化生产，限制其广泛应用。因此，选育高产菌株，改进发酵工艺和提取工艺，降低生产成本是目前迫切需要解决的问题。
　　基于前期大豆油作消泡剂显著提高抗菌脂肽产量的研究基础上，本研究以大豆油作消泡剂，对高产菌株Bacillusamyloliquefaciensfmb50进行发酵生产，开展Bacillusamyloliquefaciensfmb50产surfactin的高效提取工艺研究。同时，对纯化的surfactin乳化性及其应用进行了初步研究，旨在为surfactin工业化生产和应用提供依据。研究结果分述如下:
　　1.脂肽类生物表面活性剂的提取。采用絮凝的方法对发酵液进行预处理，首先通过单因素实验筛选最佳絮凝剂。其次，利用PB（Plackett-BurmanScreeningDesign）设计对影响surfactin提取中的关键因素进行筛选，并采用中心复合实验对筛选出的关键因素进行了优化。最后，采用打孔法对发酵液的抑菌性进行了研究。结果表明，在CaCl2、AlCl3、CaCl2和Na2HPO4、AlCl3和Na2HPO4、生化絮凝剂中，生化絮凝剂具有最好的絮凝效果，且生化絮凝剂为0.20％，surfactin回收率达88.43％;筛选出影响surfactin提取的关键因素为乙醇添加量和发酵液初始pH;确定最佳絮凝条件为乙醇添加量160％、pH为8、0.2％生化絮凝剂，此时surfactin回收率达94.54％，验证实验surfactin回收率为93.21％;确定了surfactin具有较广范围的抑菌谱，它对革兰氏阳性菌、阴性菌都有较强的抑制作用，对霉菌也有一定的效果。
　　2.脂肽类生物表面活性剂的纯化与鉴定。采用大孔树脂吸咐法对surfactin粗样后surfactin粗品进行纯化。静态吸附结果表明，D101型大孔树脂对surfactin的回收率最高。其中，吸附量166.27mg.g-1，吸附率为89.28％，解吸率为80.64％，surfactin回收率达到72.00％，纯度为32.90％。动态吸附条件为上样浓度8.853g/L，上样量5BV，洗脱速率2mL/min，洗脱剂用量13BV，surfactin的回收率达82.36％，纯度为85.75％。红外光谱分析结果显示，该物质同时具有环状肽链和脂肪烃链的结构。将纯化样品用制备型HPLC进一步纯化，分别收得1a、1b、2a、2b、2c、3峰，经LC-MS/ESI-MS分析，结果依次是m/z为994.10、994.31、1008.26、1008.27、（1008.34和1022.32）、1036.48的surfactinC13～C15同系物。经二级质谱分析2a、2b和3峰surfactin的第七位氨基酸为Leu或Ile。
　　3.脂肽类生物表面活性剂乳化性及其应用研究。采用白金板法对surfactin的表面活性进行了研究，并用浊度法和离心法对其乳化性进行了研究，以及surfactin在花生蛋白饮料中的应用研究。结果表明，surfactin的临界胶束浓度为9.03×10-5mol/L，可将水的表面张力由73.98mN/m降最低至27.48mN/m。在浓度为1×10-3mol/L～1.2×10-2mol/L的氯化钠溶液中，surfactin溶液的表面张力随盐浓度升高逐渐降低并最终稳定在34mN/m;surfactin在121℃20min处理后，其表面张力仍能保持在37.10mN/m;在pH为2～12范围内，其表面活性稳定并良好;表明surfactin具有较强的盐浓度、温度、pH的耐受性。浊度法测得surfactinHLB值为14，对所需HLB值为12～16的油相乳化性能良好，并且对花生乳具有较好的乳化作用，其效果较蔗糖酯好。

目录

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表格索引

图形索引

摘要

第一章 文献综述

1 表面活性剂

1．1 生物表面活性剂的分类与结构

1．2 生物表面活性剂的提取方法

1．3 生物表面活性剂的抗病毒和抗菌性质

2 生物表面活性剂的理化性质

2．1 表面张力

2．2 临界胶束浓度(Critical micelle concentration；CMC)

2．3 乳化性和乳化稳定性

2．4 亲水-亲油值

3 脂肽生物表面活性剂的应用

3．1 饲料添加剂

3．2 用于石油开采和环境保护

3．3 日用品和医学领域

3．4 食品乳化剂

4 本研究的目的意义及内容

参考文献

第二章 脂肽类生物表面活性剂的提取

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 CaCl2对发酵液的絮凝效果及回收率的影响

2．2 AlCl3对发酵液的絮凝效果及回收率的影响

2．3 CaCl2和Na2HPO4对发酵液的絮凝效果及回收率的影响

2．4 AlCl3和Na2HPO4对发酵液的絮凝效果及回收率的影响

2．5 生化絮凝剂对发酵液的絮凝效果及回收率的影响

2．6 Plackett-Burman关键因子的确定

2．7 Central Composite Design优化

2．8 验证性试验

2．9 surfactin纯度测定结果

2．10 抑菌谱的测定结果

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 脂肽类生物表面活性剂的纯化与结构鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 大孔树脂静态吸附与解吸

2．2 大孔树脂的动态吸附与解吸

2．3 不同浓度的乙醇洗脱对surfactin的回收率及纯度的影响

2．4 Surfactin的红外光谱分析

2．5 LC-MS／ESI-MS分析

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 脂肽类生物表面活性剂乳化性及其应用研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 临界胶束浓度的测定

2．2 NaCl浓度对surfactin溶液表面张力的影响

2．3 温度对surfactin溶液表面张力的影响

2．4 pH对surfactin溶液表面张力的影响

2．5 HLB值的测定

2．6 乳化性和乳化稳定性的测定

2．7 surfactin乳化性的应用

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

论文创新点

致谢