母猪低蛋白日粮对子代卵巢卵泡发生和类固醇生成的影响及其分子机制

摘要

胚胎和新生期是雌性动物卵巢发育的关键窗口期;新生期卵巢结构和功能的改变能够持续到成年，从而影响动物成年后的繁殖性能。母体妊娠期和哺乳期的营养能够程序化影响后代卵巢的发育，而卵泡发生(folliculogenesis)和类固醇生成(steroidogenesis)是决定卵巢发育和功能的两个关键生物学过程。但迄今为止，母体营养程序化影响后代卵巢卵泡发生和类固醇生成的研究主要集中在啮齿类动物上，在猪上的报道较少;而且，这些研究主要关注母体营养对成年后代卵巢的影响，对新生期后代卵巢的影响尚未见报道。此外，母体营养对不同发育阶段后代卵巢卵泡发生和类固醇生成的影响以及联系这两个生物学过程的分子机制还不清楚。
　　因此，研究了母猪妊娠期和哺乳期低蛋白日粮对子代新生猪和青年猪卵巢卵泡发生和类固醇生成的影响;筛选了与这些变化相关的关键效应分子;并进一步分析了两个关键基因FasL和CYP19A1的表达调控机制，讨论了关联这两个生物学过程的分子机制。
　　1、母猪妊娠期低蛋白日粮对新生仔猪卵巢卵泡发生和类固醇生成相关基因表达的影响及分子机制
　　16头经产二胎长大二元种猪发情后，用两头杜洛克种公猪的混合精液进行人工授精;一周后，随机分为标准蛋白(SP)组和低蛋白(LP)组，每组8头母猪，SP组在整个妊娠期饲喂含有15％粗蛋白的日粮，而LP组饲喂与SP组能量相等但含有7.5％粗蛋白的日粮，每天饲喂三次，时间分别为5∶00、10∶00和16∶00，妊娠前中后期饲喂的量分别为1.2 kg/d、1.8 kg/d和2.4 kg/d，每次饲喂的量相等，自由饮水。母猪分娩结束后，立即从每窝雌性仔猪中选择一头接近平均体重的仔猪，心脏采血，然后采集卵巢。
　　实验发现，LP组新生仔猪卵巢体重比显著降低(P＜0.05)，但血清中雌二醇(E2)的浓度显著升高(P＜0.05)。母猪低蛋白日粮使新生仔猪卵巢BAX和Bcl-2基因表达的比值显著升高(P＜0.05);使卵泡发育相关基因骨形态发生蛋白（BMP4)和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达显著上调（P＜0.05）。此外，母猪低蛋白日粮还使卵巢类固醇生成过程中关键酶基因细胞色素P450芳香化酶（CYP19A1）和细胞色素P45017α-羟化酶（CYP17A1）的表达显著下调（P≤0.05）;使类固醇生成重要调节基因促卵泡素受体（FSHR）和雌激素受体G蛋白偶联受体30（GPR30）的表达也显著下调(P＜0.05)。母猪低蛋白日粮没有影响新生仔猪卵巢BMP4、PCNA和CYP19A1启动子的甲基化水平，但LP组后代卵巢表达靶向BMP4基因的miR-210、靶向PCNA基因的miR-423-5p以及靶向CYP19A1基因的miR-378和miR-423-5p的丰度显著下调（P＜0.05），靶向FSHR基因的miR-423-3p的表达有下调的趋势(P=0.08)。
　　以上结果说明，母猪妊娠期低蛋白日粮影响了新生仔猪卵巢卵泡发生和类固醇生成相关的功能基因和miRNAs的表达。此外，母体蛋白限制引起的新生仔猪血清中高浓度的E2可能通过受体GPR30发挥作用。
　　2、母猪妊娠期和哺乳期低蛋白日粮对子代青年猪卵巢卵泡发生和类固醇生成的影响及分子机制
　　母猪分娩后继续饲喂，在哺乳期SP和LP组分别改为饲喂含18％和9％粗蛋白的日粮，每天饲喂两次，时间分别为10∶00和16∶00，饲喂的量为4.2 kg/d，每次饲喂的量相等，自由饮水。所有仔猪在28日龄断奶后均饲喂相同的标准日粮。6月龄时采集血清和卵巢，右侧卵巢-70℃保存用于分子生物学研究，左侧卵巢4％多聚甲醛固定用于组织形态学分析。
　　实验发现，母猪妊娠期和哺乳期低蛋白日粮没有影响后代青年猪的卵巢体重比;但使卵巢上成熟卵泡（graafian follicles）的数目显著减少（P＜0.05）;这与LP组后代卵巢上成熟卵泡中颗粒细胞的凋亡显著增加(P＜0.05)相一致。母猪妊娠期和哺乳期低蛋白日粮使后代青年猪卵巢凋亡相关基因Fas及其配体FasL的表达显著上调(P＜0.05)，凋亡相关蛋白FasL和激活型Caspase-3的表达也显著升高（P＜0.05）;但没有影响自噬相关蛋白LC3和ATG12的表达。母猪妊娠期和哺乳期低蛋白日粮还使后代青年猪血清中E2的浓度显著升高(P＜0.01)，这与LP组后代卵巢类固醇激素生成过程中关键酶CYP19A1的蛋白表达显著升高(P＜0.05)相一致，但CYP19A1基因的表达则显著下调（P＜0.05）。母猪蛋白限制使后代青年猪卵巢雌激素受体ERα和ERβ基因表达的比值显著升高（P＜0.05），使ERα的蛋白表达显著上调（P＜0.05）。
　　以上结果说明，母猪妊娠期和哺乳期低蛋白日粮可能通过上调FasL的表达激活Fas/FasL-Caspase3通路，导致后代青年猪卵巢上成熟卵泡凋亡的增加及其数目的减少;母猪蛋白限制可能通过调控CYP19A1的表达影响后代青年猪卵巢E2的生成，从而导致其血清中E2浓度的改变;母猪蛋白限制造成的后代青年猪血清中升高的E2可能通过ERα发挥作用。
　　3、母猪妊娠期和哺乳期低蛋白日粮对子代青年猪卵巢FasL和CYP19A1基因的表达调控
　　染色质免疫共沉淀技术（ChIP）检测转录因子ER与CYP19A1和FasL启动子的结合水平，结果发现，母猪蛋白限制没有影响ER与CYP19A1启动子的结合水平，但使ERα与FasL启动子的结合水平显著增加（P＜0.05），这与FasL基因表达的上调相一致。母猪妊娠期和哺乳期低蛋白日粮没有影响后代青年猪卵巢上靶向FasL基因的miRNAs表达;但是，靶向CYP19A1基因的9个miRNAs中的6个miRNAs的表达均显著下调(P＜0.05)。
　　以上结果说明，母猪妊娠期和哺乳期蛋白限制可能通过转录因子ER在转录水平调节了FasL的表达，从而激活了卵巢卵泡发生;而通过miRNAs在转录后水平调节了CYP19A1的表达，从而激活了卵巢类固醇生成。
　　综上所述，母猪妊娠期低蛋白日粮通过miRNAs在转录后水平调节了新生仔猪卵巢卵泡发生和类固醇生成相关的功能基因的表达;母体妊娠期和哺乳期低蛋白日粮通过miRNAs在转录后水平调节了子代青年猪卵巢CYP19A1的表达，使E2的生成增加，升高的E2通过增加ERα与FasL启动子的结合水平激活FasL的转录，从而激活Caspase通路，导致成熟卵泡中颗粒细胞的凋亡增加，造成其数目的减少;母猪蛋白限制造成的高水平的E2在新生猪卵巢上可能通过GPR30发挥作用，而在青年猪卵巢上则通过ERα发挥作用。

目录

声明

摘要

缩略语

引言

第一章 母体营养对后代繁殖功能的影响

1 母体营养对子代原始生殖细胞重编程和分化发育的影响

2 母体营养对子代胚胎发育和存活率的影响

3 母体营养对子代下丘脑-垂体-性腺轴发育和性成熟的影响

4 母体营养对雌性子代繁殖功能的影响

5 母体营养对雄性子代繁殖功能的影响

6 母体营养对F2代的跨代影响

第二章 卵巢卵泡发生及其调控的研究进展

1 卵巢卵泡发生

2 多日巢卵泡发生的生理调控

3 营养对卵巢卵泡发生的影响

第三章 卵巢类固醇生成及其调控的研究进展

1 卵巢类固醇生成

2 卵巢类固醇生成的生理调控

3 营养对卵巢类固醇生成的影响

4 类固醇生成与卵泡发生的相互关系

第四章 母猪低蛋白日粮对新生仔猪卵巢卵泡发生和类固醇生成相关基因表达的影响及分子机制

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 母猪低蛋白日粮对子代青年猪卵巢卵泡发生的影响及分子机制

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第六章 母猪低蛋白日粮对子代青年猪卵巢类固醇生成的影响及分子机制

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第七章 母猪低蛋白日粮对子代青年猪卵巢FasL和CYP19A1基因的表达调控

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

总体讨论

结论

本文创新点

参考文献

致谢

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