一种恒河猴卵巢及卵泡生成模型的制备方法

摘要

本发明提供了一种恒河猴卵巢及卵泡生成模型的制备方法，它是由雌性恒河猴为试验对象，经皮下注射促黄体激素LH，60IU/只/次，每天2次，连续7天，制备成恒河猴卵巢及卵泡生成模型。本发明还提供了促黄体激素LH在制备激活卵巢及其卵泡发育的药物中的用途。本发明造模方法使用动物为猴，其生理学、血液学、血液生化等背景数据丰富易得，并且猴与人生物学背景相似，猴的结果能较好地预示药物在临床上反应；多方面、多角度评估，结果能较好、客观地反应药物对生殖系统的药效作用，此外，本模型使用的动物(猴)及仪器(B超仪、显微镜、细胞培养装置等)简单易得，具有通用性。

说明书

技术领域

本发明提供了一种恒河猴卵巢及卵泡生成模型的制备方法。

背景技术

促黄体激素LH是一种糖蛋白激素，与FSH(促卵泡素α注射剂，FSH) 一样是诱发排卵的主要因素之一。在雌性哺乳动物，LH的主要作用是与FSH 协同促进卵泡生长成熟，参与内膜细胞合成雌激素，并可诱发排卵，促进黄 体生成，另外还有增加血流量的作用(张冬杰，等，促黄体激素基因(LH) 与产仔数性状关系的初步研究，《黑龙江畜牧兽医》，2005年5期)。在保证 卵巢类固醇激素合成及触发排卵发生中的作用是众所周知的。张云山，等， LH在卵泡发育及卵巢刺激中的作用，国外医学计划生育分册2002年21卷 第3期。目前尚无采用LH制备恒河猴卵巢及卵泡生成模型的相关报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种恒河猴卵巢及卵泡生成模型的制备方 法。

本发明提供了一种恒河猴卵巢及卵泡生成模型的制备方法，它是由雌性 恒河猴为试验对象，经皮下注射促黄体激素LH，60IU/只/次，每天2次，连 续7天，制备成恒河猴卵巢及卵泡生成模型。本发明还提供了促黄体激素LH 在制备激活卵巢及其卵泡发育的药物中的用途。

本发明造模方法使用动物为猴，其生理学、血液学、血液生化等背景数 据丰富易得，并且猴与人生物学背景相似，猴的结果能较好地预示药物在临 床上反应；LH临床通常用于诱导同期排卵，给药后对卵巢的作用效果确实、 稳定，其重现性较好；本模型从动物体内试验、激素水平、B超影像、细胞 水平等多方面、多角度评估，结果能较好、客观地反应药物对生殖系统的药 效作用，此外，本模型使用的动物(猴)及仪器(B超仪、显微镜、细胞培 养装置等)简单易得，具有通用性。

附图说明

图1大卵泡数与总卵泡数柱形图

具体实施方式

实验例1本发明动物模型的制备

以4只适繁期雌性恒河猴(A、B、F、H)为试验对象，标准的FSH(Gonal  F)(促卵泡素α注射剂，FSH)为参照，完全随机化设计，于相同的生殖生 理周期，自月经周期的2天开始，分别对A、H猴经皮下注射LH、60IU/只/ 次、每天2次、连续7天，B、F猴经皮下注射Gonal F、60IU/只/次、每天 2次、连续7天，于月经周期第9天对受试猴卵巢状态作B超检测，于月经 周期第10天一次性肌注1000国际单位(IU)的人绒膜促性腺激素(hCG)， 并在注射hCG后30小时作手术采卵、成熟培养与体外受精。通过综合分析比 较B超检测、手术采卵、成熟培养及体外受精等试验结果，可以初步判定(推 断)：受试验药物LH的促卵巢及其卵泡发育的的主要药效学指标已达到或超 过Gonal F(只平总卵泡数33/15；只平≥5mm卵泡数16/9)；卵母细胞体外 成熟培养的成功率组间亦无明显差异(0.825/0.875)。

1、试验目的

以适繁期雌性恒河猴为试验对象，标准的FSH(Gonal F)为参照，完全 随机化设计，于相同的生殖生理周期，对猴只分别施以受试验药物FSH类似 物LH和标准的FSH(Gonal F)治疗处理，综合分析比较B超检测、手术采 卵、成熟培养及体外受精等试验结果，以判定受试验药物LH的促卵巢及其卵 泡发育、成熟的效果与影响以及不同药物间可能存在的差异趋势。

2、试验材料

2.1供试品

2.1.1基本信息

LH、Gonal F各4支，1.5mL/支，600IU/ml；稀释剂2支，40mL/支； HCG 4支，1mL/支，2000IU/ml。均为无色透明液体，由前沿生物技术公 司提供，于-80℃保存。

2.1.2配制方法

LH、Gonal F分别于首次给药当天解冻(稀释剂亦同期解冻)，室温下按 每只猴用量一次性稀释配制完成，并在每次用后于4℃保存待用；HCG于月 经期第10天(即B超检测后次日)解冻，生理盐水稀释(0.5mm)。

2.2实验动物

普通级健康恒河猴4只，雌性，体重5.0～8.0kg，由四川成都平安动物 繁育研究基地引进。入室前一周经结核菌素、寄生虫、沙门氏菌、致贺氏菌 检查阴性。恒河猴饲养于国家成都中药安全性评价中心普通动物房，实验前 动物适应环境并进行体内外驱虫，检测体温、血液学、血生化、电解质、粪 尿和心电图指标二次。受试动物于不锈钢猴笼分笼饲养，饲养条件符合国标 GB 14925-2001，室温21±5℃，相对湿度55±15％，10/14小时明暗交替。 猴精饲料喂养，自来水装瓶自由饮用，每日添加VE、水果、蔬菜。

2.3试剂及仪器设备

凸阵超声诊断仪(WEUC-602)、体视显微镜(Leica S6E)、倒置显微 镜(Nikon，ECLIPSE TS100)、照相或录像设备、CO₂培养箱(SANYO， MCO175)、离心机(TD3)、水浴锅(华普达，HH-4)、恒温台(KITAZATO， MP-30DM)、微量移液器(eppendof，1000μL)、移液枪架、酒精灯、超净 工作台(ESCO，AVC-6A1)、自制移卵针(橡皮管、玻璃珠)、表面皿、玻 璃培养皿(60mm)、一次性培养皿(35mm)、Eppendorf离心管、枪头、记 号笔、标签纸、封口膜、酒精棉球、托盘、载玻片、盖玻片、血细胞计数板、 工作服、手套、口罩、帽子、烧杯等。

表1主要试剂

3试验方法和观察指标

3.1分组与剂量设计

将4只猴(编号A、B、F、H)随机分为2组，其中A、H猴经皮下注 射LH，60IU/只/次，每天2次，连续7天；B、F猴经皮下注射Gonal F，60IU/ 只/次，每天2次，连续7天(表2)。首次试验后待动物体内药物消除2个 月，进行第2阶段试验，其中A、H猴经皮下注射Gonal F，B、F猴经皮下 注射LH，60IU/只/次，每天2次，连续7天。

表2剂量设计

3.2试验方法

3.2.1对雌猴促生殖(卵泡发育、成熟)的药物处理

时间：经预饲养期观察和血样激素监测确定供试猴已进入真性月经周期 后，于下次月经周期的2天开始给药。其中：A、H猴经肌肉皮下注射LH； B、F猴经皮下注射Gonal F。

剂量：60IU/次，每日2次，连续7天。

在上述两类药物处理后，于月经周期第9天用氯氨酮麻醉，对受试猴卵 巢状态作B超检测，以初步判明卵巢及其卵泡发育情况。再于月经周期第10 天一次性肌注1000国际单位(IU)的人绒膜促性腺激素(hCG)(0.5mL生 理盐水)，以刺激卵细胞的成熟。

3.2.2卵细胞收集

在注射hCG后30小时，对受试猴经静脉注射戊巴比妥钠(25mg/kg，根 据猴麻醉后具体情况，酌情增加用量)，待翻正反射消失、肌肉松驰后，仰卧 位固定四肢和头部；将下腹部至耻骨联合处去毛，消毒腹部及大腿上1/4处， 铺创巾；于耻骨联合处向上4cm左右沿腹部正中线向上做3～5cm的切口，逐 层开腹，暴露卵巢；观察测量卵巢大小，计算卵巢表面直径分别为2mm、3mm、 4mm、5mm、6mm、7mm、8mm的卵泡数，并作详细记录和拍照(卵泡 分级：一级卵泡，直径为660-840μm；二级卵泡，直径＞840-1000μm；大腔 卵泡则分为三级卵泡及四级卵泡，直径分别＞1000-1400μm和＞1400μm；退化 或闭锁的卵泡)。用手术法采集卵子，即从卵巢上直径≥5mm的囊状卵泡或成 熟卵泡吸取尚处于第一次成熟分裂前期或成熟分裂复始期的初级卵母细胞连 同完整的卵丘细胞团，放入含肝素的TALP-HEPES液中(37℃)供检卵和体 外培养，并拍照；同时，还需仔细检查记录卵巢上已存出现的自然排卵点(含 新生黄体)，以便计算发育卵泡总数、采集卵总数及采集率等；检查无活动性 出血后，逐层关腹。

3.2.3检卵

将盛有卵母细胞的表面皿置于体视镜于20-40倍下检查计数，记录卵母 细胞收集数，计算收集率；将盛有卵母细胞的表面皿置于倒置显微镜于 100-400倍下检查记录正常卵和异常卵数，并计算正常卵百分率、正常与异 常卵比率。正常卵判定标准：卵丘细胞致密、放射冠透明带完整、细胞充盈 均质或卵丘细胞略微散在但放射冠透明带完整、细胞充盈均质。凡卵丘细胞 缺失、放射冠不完整或透明带破裂、细胞皱缩或细胞内容物欠均质均判为异 常细胞。检卵液预热恒温(37-38℃)，整个检卵过程要求恒温(37-38℃)、 快速(1-3分钟)、准确。

3.2.4卵母细胞的体外成熟(IVM)

选择处于GV期卵母细胞用IVM液洗涤3-5次后，挑选卵丘细胞致密、 放射冠完整、卵母细胞球形饱满均质无空洞的卵供体外培养进行成熟分裂I， 达到可以受精的成熟阶段，此时镜检应观察到在透明带内的卵黄周隙存在一 个极体-第I极体。具体方法：

培养液：mCMRL-1066+5μg/mL ovine FSH+10μg/mL ovine LH+ 100ng/mL E2+3μg/mL P4。

培养条件：100％湿度，5％CO2，37℃。

培养时间：22+/-1h；24，32，40+/-1小时。

培养观察：观察卵丘细胞扩展情况以及消化卵丘细胞观察第一极体排出 情况。

3.2.5精液处理

在30℃的TALP液中解冻精液，并孵化15-20分钟。

精子上浮：37°孵化30-45分钟，然后转移上层300μl(上浮重复2次)， 调节密度2～4×10⁶

3.2.6精子体外获能(Capacitation)

将品质检查合格的精液移入经置于CO₂培养箱预热平衡的获能液2mL 中孵育30min，300×g7min离心洗涤1次，再孵育30min，取上清液(富含高 活力精子)500×g7min离心分离出除去精请的精子，移入预平衡好的含肝素 的获能液2mL中于培养箱中上浮30min。取上层活精子500×g离心7min， 将精子沉淀悬浮于200ul的获能液中。受精前1hr，再用加入dbcAmp和咖 啡因的获能液诱导精子获能，制成20ul的受精微滴供精卵共培养用。精子在 获能培液中培养的总计约4hr-7h。受精微滴中精子含量约为(1-5)×10⁶个/mL。 培养箱条件为38.5℃、100％湿度、5％CO2的空气、无菌。

3.2.7取精卵共培养方法完成体外受精

将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤4次后，置于受精微滴中(每微滴 可容10-20个卵母细胞)，加入经悬浮处理的活精子，于培养箱中共培养12-20 小时。取出卵母细胞用发育培养液洗涤4次，再转入发育培养液中继续培养。 培养箱条件为38.5℃、100％湿度、5％CO₂的空气、无菌。

从获能液中外部吸取10μl精液，加到40μl已经预孵化的含有体外成熟 了的卵母细胞的IVF培养液(37°共孵化18-24小时)，观察原核出现情况。

3.2.8受精卵体外培养与鉴定

受精18-24h后取出卵母细胞，去除卵丘，于倒置显微镜100-400倍下检 查记录有第II极体的或卵裂的卵细胞数量；对无法判明第II极体或卵裂的卵 细胞，须进一步作固定染色，观察2个原核形成的情况。将已形成原核、或 已排放第II极体、和已卵裂的的卵记为受精，并计算受精率。

3.2.9血样采集与保存

(1)观察期：于雌猴出现月经周期的第2天和第8天分别两次采血各 2mL制作血清(每样等量双管)，作好样管标记，及时外作激素(雌二醇) 测定，以判定其真性月经周期(含有卵泡发育的性周期)，确保试验给药对象 处于适宜的生殖生理状和取得客观的试验结果。

(2)试验期：给药前所有动物抽外周血2mL/只，制成抗凝血浆作为对照。 自给药的第一天开始到卵细胞吸出后一周，每隔一天给所有动物抽外周血 2mL/只。每次采集的血样将制作肝素或EDTA抗凝血浆，等量移至两样管中 标记、密封，置于-70℃冰箱保存，血浆样品标记为动物名(A，B，C，D)， 所给药物(a或b分别代表Gonal F和FSH analog LH)。给药天数，并在前 面添加本次试验代号FB121-101。比如动物A，第一阶段给药Gonal F，给药 第三天的样品应标记为FB121-101Aa3。

(3)抗体检测血样采集：在给药前第三天和给药第15天，30天、第60 天另抽血2mL，不加抗凝剂制备成血清，用于测抗体滴度。按上述方法标记 为FB121-101SAa-3(S表示血清，A代表动物编号，a表示药物Gonal F，-3 表示给药前第3天)

3.2.10抗体检测

在给药第15天，30天、第60天采集2mL外周血，2000rpm离心5min 制备血清用于抗体检测，给药前3天正常血清作为阴性对照。

3.2.11实验观察

对每只动物每天一次的笼旁观察，并详细纪录动物状况和异常发现(含药 物反应)。对于特殊的异常表现必须如实记录，及时反馈委托方，并应委托方 要求对动物及试样、结果拍照或增补其它处理。

3.2.12术后跟踪

对接受了剖腹手术的动物，肌肉注射丁丙诺啡，0.01-0.03mg/kg，6-12 小时间歇期，至少再重复三次。除此之外还可以用每6-12小时肌注或口服 2-5mg/kg的酮洛芬来代替，额外的镇痛剂仅在兽医的指导下使用。

每天检查动物一次，使用过止痛药物的动物术后每天观察2次，以保证 术后恢复，防止意外事故的。用麻醉药的动物术后至清醒后返回其家笼期间 至少每15分钟观察一次。观测指标包括麻醉清醒时间，正常活动、进食饮水、 普通警觉和种群特殊行为的恢复时间；手术切口需要观察5天以上，看是否 有红、肿或其它不适表现，并采取相应的兽医措施。

4观察指标

4.1雌激素水平

于月经周期第2、8天从动物后肢静脉采集血液2mL，分离血清后进行 雌激素(E2)检测。

4.2B超检测

于动物月经周期第9天进行B超检测。

4.3手术采卵

给予动物HCG30小时后进行剖腹手术，观察卵巢状态(体积、活化度)、 卵泡数量及其大小。记录≥5mm卵泡中的卵母细胞采集数并计算其收集率。

4.4卵母细胞培养

记录卵母细胞体外培养成熟率。

4.5精卵共培养

计算卵母细胞体外受精率。

4.6抗体检测

于给药前3天和给药第15、30、60天从动物后肢静脉采集血液2mL，分离 血清后进行抗体检测。

4.试验结果

4.1FSH类似物LH的猴药效学预试验结果汇总

表3.1FSH类似物LH的猴药效学预试验结果汇总表(第1阶段)

表3.2FSH类似物LH的猴药效学预试验结果汇总表(第2阶段)

4.2主要药效学结果统计

表4.FSH类似物LH的猴药效学预试验主要药效学结果统计表

注：手术采卵时间：A、B猴18/11-05；F猴03/12-05；H猴11/12-05

4.3检卵、体外受精结果统计(表5-1、表5-2)

表5-1.LH组检卵、体外受精结果统计

卵细胞供体       A猴             日期2005.11.18

精子供体#        猕猴7号冻精     项目：FSH类似物LH的猴药效学预试验

表5.-2Gonal F组检卵、体外受精结果统计

卵细胞供体         B猴          日期2005.11.18

精子供体#          猕猴7号冻精  项目：FSH类似物LH的猴药效学预试验

4.4一般状态观察

给药第1天至给药结束，均可见各组动物在给药部位红肿，给药部位皮 下稍有出血。上述症状于给药结束2天后逐渐消失。手术后，B猴及F猴缝 合部位无肿胀、发炎，A猴及H猴缝合部位稍有肿胀(可能为组织液渗出或 少量出血)，3天后逐渐消失。

动物经术后护理，其一般行为、运动状态、呼吸、摄食及排便都恢复正常。 其余未见异常。

分析讨论

5.1主要药效学指标比较分析：

LH组在卵巢体积、活化程度和平均卵泡总数以及5mm的卵泡数量等方 面均表现出优于Gonal F组的趋势。

5.2各项学效学观察指标比较分析：

E2检测：周期第2天E2水平，除个别猴(F猴)外，均表明卵巢开始 活化并有卵泡发育(启动)，LH组稍高于Gonal F组，即首次给药时的内源 激素水平组间略存差异；连续7天给药于周期芽8天时的E2水平，LH组显 著高于Gonal F组，表明以相同剂量水平和处理方法程序，LH组激活卵巢、 促卵泡发育的生物效应明显强于Gonal F组，这一结果与B超检测和手术观 察和采卵结果相一致。

5.3一种趋势

手术观查可看到这样一种趋势，促卵泡发育数的数量越多，其大卵泡的 比率则相对偏少，特别是H猴，卵泡发育最多，38个，但≥5mm仅8个， 占可见卵泡数的21.05％，而且术后至第一次月经出时间明显推迟(术后至今 未出现月经)。

5.4卵母细胞体外培养成熟率

卵母细胞体外培养成熟率组间差异不甚明显。

5.5术后卵巢功能休复

除个别猴(H猴)外，组间或猴只间尚未见明显差异结果。

5.6其它：

鉴于采卵后要用于体外培养和体外受精，故检卵力求快速，无法仔细观 察分析卵母细胞的质量。但从总体看，存在卵子质量随超排结果数量越大而 下降的趋势。

6结论

综上结果分析讨论，本期预试结果表明，LH在激活卵巢及其卵泡发育 的主要药效方面，己达到或超过Gonal F的药效。